Осаждение этанолом - Ethanol precipitation

Осаждение этанолом это метод, используемый для очистки и / или концентрирования РНК, ДНК, и полисахариды Такие как пектин и ксилоглюкан из водные растворы добавляя этиловый спирт как антирастворитель.

Осаждение ДНК

Теория

Первый гидратная оболочка иона натрия, растворенного в воде

ДНК полярный из-за его сильно заряженного фосфат позвоночник. Полярность делает его водорастворимым (вода полярна) по принципу "подобное растворяется в подобном".

Из-за высокой полярности воды, что подтверждается ее высокой диэлектрическая постоянная 80,1 (при 20 ° C), электростатические силы между заряженные частицы в водном растворе значительно ниже, чем в вакуум или в воздухе.

Эта связь отражена в Закон Кулона, который можно использовать для расчета силы, действующей на два заряда ${displaystyle q_ {1}}$ и ${displaystyle q_ {2}}$ разделенные расстоянием ${displaystyle r}$ используя диэлектрическую проницаемость ${displaystyle varepsilon _ {r}}$ (также называемая относительной статической диэлектрической проницаемостью) среды в знаменателе уравнения ( ${displaystyle varepsilon _ {0}}$ является электрическая постоянная ):

${displaystyle F = {frac {1} {4pi varepsilon _ {r} varepsilon _ {0}}} {frac {q_ {1} q_ {2}} {r ^ {2}}}}$

На атомном уровне уменьшение силы, действующей на заряд, происходит в результате того, что молекулы воды образуют гидратная оболочка вокруг него. Этот факт делает воду очень хорошим растворителем для заряженных соединений, таких как соли. Электрическая сила, которая обычно удерживает соль кристаллы вместе посредством ионные связи ослабляется в присутствии воды, позволяя ионам отделяться от кристалла и распространяться по раствору.

Тот же механизм действует в случае отрицательно заряженных фосфатных групп на основной цепи ДНК: даже если в растворе присутствуют положительные ионы, относительно слабая суммарная электростатическая сила не позволяет им образовывать стабильные ионные связи с фосфатами и осаждающий из решения.

Этиловый спирт гораздо менее полярен, чем вода, с диэлектрической проницаемостью 24,3 (при 25 ° C). Это означает, что добавление этанола к раствору нарушает экранирование зарядов водой. Если добавлено достаточное количество этанола, электрическое притяжение между фосфатными группами и любыми положительными ионами, присутствующими в растворе, становится достаточно сильным для образования стабильных ионные связи и осаждение ДНК. Обычно это происходит, когда этанол составляет более 64% раствора. Согласно механизму, раствор должен содержать положительные ионы, чтобы произошло осаждение; обычно Na⁺, NH₄⁺ или Ли⁺ играет эту роль.^[1]

Упражняться

Лабораторная настольная центрифуга

ДНК преципитируют, сначала убедившись, что в растворе присутствует правильная концентрация положительных ионов (слишком много приведет к соосаждению большого количества соли с ДНК, слишком мало приведет к неполному восстановлению ДНК), а затем добавлением двух-трех объемов не менее 95% этанола. Многие протоколы рекомендуют хранить ДНК при низкой температуре в этот момент, но есть также наблюдения, что это не может улучшить восстановление ДНК и может даже снизить эффективность осаждения при использовании времени инкубации в течение ночи.^[2]^[3] Следовательно, хорошая эффективность может быть достигнута при комнатной температуре, но если принять во внимание возможную деградацию, вероятно, лучше инкубировать ДНК на влажном льду. Оптимальное время инкубации зависит от длины и концентрации ДНК. Меньшие фрагменты и более низкие концентрации потребуют более длительного времени для достижения приемлемого восстановления. Для очень малых размеров и низких концентраций рекомендуется инкубация в течение ночи. В таких случаях использование таких перевозчиков, как тРНК, гликоген или линейный полиакриламид может значительно улучшить восстановление.

Во время инкубации из раствора выпадут в осадок ДНК и некоторые соли, на следующем этапе этот осадок собирается с помощью центрифугирование в пробирке для микроцентрифуги на высоких скоростях (~ 12000грамм ). Время и скорость центрифугирования имеют наибольшее влияние на скорость восстановления ДНК. Опять же, более мелкие фрагменты и более высокие разведения требуют более длительного и быстрого центрифугирования. Центрифугирование можно проводить либо при комнатной температуре, либо при 4 ° C или 0 ° C. Во время центрифугирования осажденная ДНК должна перемещаться через раствор этанола на дно пробирки, более низкие температуры увеличиваются. вязкость раствора и большие объемы увеличивают расстояние, поэтому оба этих фактора снижают эффективность этого процесса, требующего более длительного центрифугирования для того же эффекта.^[2]^[3]После центрифугирования супернатант удаляют, оставляя гранула сырой ДНК. Видимость осадка зависит от количества ДНК и от ее чистоты (более грязные гранулы легче увидеть) или от использования соосадителей.

На следующем этапе к осадку добавляется 70% этанол, и он осторожно перемешивается, чтобы отделить гранулу и промыть ее. Это удаляет часть солей, присутствующих в оставшемся супернатанте и связанных с осадком ДНК, делая окончательную очистку ДНК. Эту суспензию снова центрифугируют, чтобы снова осадить ДНК, и надосадочный раствор удаляют. Этот шаг повторяется один раз.

Наконец, осадок сушат на воздухе и ресуспендируют ДНК в воде или другом желаемом растворе. буфер. Важно не пересушивать гранулы, так как это может привести к денатурация ДНК и затруднить ресуспендирование.

Изопропанол также можно использовать вместо этанола; эффективность осаждения изопропанола выше, поэтому одного объема достаточно для осаждения. Однако изопропанол менее летуч, чем этанол, и ему требуется больше времени для сушки на воздухе на заключительном этапе. Гранула также может менее плотно прилипать к трубке при использовании изопропанола.^[1]

Смотрите также

внешняя ссылка

bitesizebio.com Основы: как работает осаждение ДНК и РНК этанолом
Зейгин Дж. А., Хартли Дж. Л. (1985). «Осаждение ДНК этанолом» (PDF). Фокус. 7 (4): 1–2. Получено 2008-09-10.
Crouse J, Amorese D (1987). «Осаждение этанолом: ацетат аммония как альтернатива ацетату натрия» (PDF). Фокус. 9 (2): 3–5. Архивировано из оригинал (PDF) на 2009-11-22. Получено 2008-09-10.

[a0-1] а ^б Молекулярное клонирование: лабораторное руководство (третье издание). Джозеф Сэмбрук, Институт рака Питера МакКаллума, Мельбурн, Австралия; Дэвид Рассел, Юго-западный медицинский центр Техасского университета, Даллас

[a1-2] а ^б Зейгин Дж. А., Хартли Дж. Л. (1985). «Осаждение ДНК этанолом» (PDF). Фокус. 7 (4): 1–2. Получено 2008-09-10.

[a2-3] а ^б Crouse J, Amorese D (1987). «Осаждение этанолом: ацетат аммония как альтернатива ацетату натрия» (PDF). Фокус. 9 (2): 3–5. Архивировано из оригинал (PDF) на 2009-11-22. Получено 2008-09-10.

[1]

[2]

[3]