Кислотная экстракция тиоцианат-фенол-хлороформ гуанидиния - Acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction

PhOH-CHCl3 extract.svg

Кислотная экстракция тиоцианат-фенол-хлороформ гуанидиния (сокращенно AGPC) это жидкость – жидкостная экстракция техника в биохимия. Он широко используется в молекулярная биология для изоляции РНК (а также ДНК и белок в некоторых случаях). Этот метод может занять больше времени, чем колоночная система такие как очистка на основе диоксида кремния, но имеет более высокую чистоту и преимущество высокого извлечения РНК:[1] колонка с РНК обычно не подходит для очистки коротких (<200 нуклеотиды ) Виды РНК, такие как миРНК, miRNA, гРНК и тРНК.

Первоначально он был разработан Петром Хомчинским и Николетта Сакки, которые опубликовали свой протокол в 1987 году.[2][3] Реагент продается в Сигма-Олдрич под названием TRI Reagent; к Invitrogen под именем ТРИЗОЛ; к Биолин как Trisure; и Tel-Test как STAT-60.

Как это устроено

Этот метод основан на разделении фаз путем центрифугирования смеси водного образца и раствора, содержащего водонасыщенный фенол и хлороформ с образованием верхней водной фазы и нижней органической фазы (в основном фенола). Тиоцианат гуанидиния, а хаотропный агент, добавляется к органической фазе, чтобы способствовать денатурации белков (например, белков, которые прочно связывают нуклеиновые кислоты или белков, разрушающих РНК). Нуклеиновые кислоты (РНК и / или ДНК) разделяются на водную фазу, а белок разделяется на органическую фазу. PH смеси определяет, какие нуклеиновые кислоты будут очищены.[4] В кислых условиях (pH 4-6) ДНК разделяется на органическую фазу, а РНК остается в водной фазе. В нейтральных условиях (pH 7-8) оба ДНК и Раздел РНК в водную фазу. На последней стадии нуклеиновые кислоты выделяют из водной фазы путем осаждения с помощью 2-пропанол. Затем 2-пропанол промывают этиловый спирт и осадок кратковременно сушили на воздухе и растворяли в буфере ТЕ или воде, свободной от РНКаз.

Тиоцианат гуанидиния денатурирует белки, включая РНКазы, и отделяет рРНК от рибосомных белков, в то время как фенол, изопропанол и вода - растворители с плохой растворимостью. В присутствии хлороформ или BCP (бромхлорпропан ), эти растворители полностью разделяются на две фазы, которые распознаются по их цвету: прозрачная верхняя водная фаза (содержащая нуклеиновые кислоты) и нижняя фаза (содержащая белки, растворенные в феноле, и липиды, растворенные в хлороформе). Такие как 2-меркаптоэтанол и саркозин также могут быть использованы. Главный недостаток в том, что фенол и хлороформ являются опасными и неудобными материалами, а их извлечение часто бывает трудоемким, поэтому в последние годы многие компании предлагают альтернативные способы выделения РНК.

Реагенты

  • Фенол: Фенол, используемый для биохимия поставляется в виде водонасыщенного раствора с Трис-буфер, в виде 50% фенола, 50% раствора хлороформа, забуференного Трис, или 50% фенола, 48% хлороформа, 2% изоамиловый спирт решение (иногда его называют «25: 24: 1»). Фенол от природы несколько водорастворим и дает нечеткую поверхность раздела, которая усиливается из-за присутствия хлороформа, а изоамиловый спирт снижает пенообразование. Большинство растворов также содержат антиоксидант, так как окисленный фенол повреждает нуклеиновые кислоты. Для очистки РНК поддерживают значение pH около 4, что позволяет удерживать РНК преимущественно в водной фазе. Для очистки ДНК значение pH обычно составляет около 7, при этом все нуклеиновые кислоты находятся в водной фазе.
  • Хлороформ: Хлороформ стабилизирован небольшими количествами амилен или же этиловый спирт, поскольку воздействие кислорода и ультрафиолета на чистый хлороформ приводит к фосген газ. Некоторые растворы хлороформа представляют собой предварительно приготовленную смесь 96% хлороформа и 4% изоамилового спирта, которую можно смешать с равным объемом фенола для получения раствора 25: 24: 1.
  • Изоамиловый спирт: Изоамиловый спирт может уменьшить пенообразование и обеспечить дезактивацию РНКаз.

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ Моррисон; и другие. (2003). «Сравнение AGPC с очисткой нуклеиновых кислот на колонке». Журнал биомолекулярных технологий. 21 (17): 411–432.
  2. ^ Chomczynski, P .; Сакки, Н. (1987). «Одностадийный метод выделения РНК кислотной экстракцией тиоцианат-фенол-хлороформ гуанидиния». Анальный. Biochem. 162 (1): 156–159. Дои:10.1016/0003-2697(87)90021-2. PMID  2440339.
  3. ^ Chomczynski, P .; Сакки, Н. (2006). «Одностадийный метод выделения РНК кислотной экстракцией тиоцианат-фенол-хлороформ гуанидиния: двадцать с лишним лет спустя». Протоколы природы. 1 (2): 581–585. Дои:10.1038 / nprot.2006.83. PMID  17406285. S2CID  28653075.
  4. ^ Перри Р.П., Ла Торре Дж., Келли Д.Е., Гринберг-младший. (1972) О лабильности последовательностей поли (А) при экстракции информационной РНК из полирибосом. Биохим. Биофиз. Acta 262: 220–226; Brawerman G, Mendecki J, Lee SY. (1972) Процедура выделения рибонуклеиновой кислоты-мессенджера млекопитающих. Биохимия 11: 637–641.

внешняя ссылка