Насыщенный мутагенез - Википедия - Saturation mutagenesis

Насыщенный мутагенез одного положения в теоретическом протеине с 10 остатками. Версия белка дикого типа показана вверху, где М представляет собой первую аминокислоту метионин, а * представляет собой окончание трансляции. Все 19 мутантов в положении 5 показаны ниже.

Мутагенез с насыщением сайтов (SSM), или просто насыщенность сайта, это случайный мутагенез техника, используемая в белковая инженерия, в котором сингл кодон или набор кодонов заменяется всеми возможными аминокислоты на позиции.[1] Есть много вариантов техники насыщения сайта, от насыщенность парных сайтов (насыщение двух позиций в каждом мутанте в библиотеке), чтобы насыщенность места сканирования (выполнение насыщения каждого сайта в белке, в результате чего получается библиотека размером [20 x (количество остатков в белке)], которая содержит все возможные точечный мутант белка).

Метод

Описание одного из распространенных способов клонирования библиотеки сайт-направленного мутагенеза (т.е. с использованием вырожденных олигонуклеотидов). Интересующий ген подвергается ПЦР с олигонуклеотидами, которые содержат область, которая полностью комплементарна матрице (синий), и область, которая отличается от матрицы одним или несколькими нуклеотидами (красный). Многие такие праймеры, содержащие вырожденность в некомплементарной области, объединяются в одну и ту же ПЦР, что приводит к множеству различных продуктов ПЦР с разными мутациями в этой области (отдельные мутанты показаны разными цветами ниже).

Насыщенный мутагенез обычно достигается сайт-направленный мутагенез ПЦР с рандомизированным кодоном в праймерах (например, SeSaM )[2] или по искусственный синтез генов, со смесью синтеза нуклеотиды используется в кодонах, которые необходимо рандомизировать.[3]

Для кодирования наборов аминокислот можно использовать различные вырожденные кодоны.[1] Поскольку некоторые аминокислоты кодируются большим количеством кодонов, чем другие, точное соотношение аминокислот не может быть равным. Кроме того, обычно используют вырожденные кодоны, которые минимизируют стоп-кодоны (что обычно нежелательно). Следовательно, полностью рандомизированный «NNN» не идеален, и используются альтернативные, более ограниченные вырожденные кодоны. «NNK» и «NNS» имеют то преимущество, что кодируют все 20 аминокислот, но все же кодируют стоп-кодон в 3% случаев. Альтернативные кодоны, такие как «NDT», «DBK» полностью избегают стоп-кодонов и кодируют минимальный набор аминокислот, который по-прежнему охватывает все основные биофизические типы (анионные, катионные, алифатические гидрофобные, ароматические гидрофобные, гидрофильные, малые).[1] В случае отсутствия ограничений на использование только одного вырожденного кодона можно значительно уменьшить смещение.[4][5] Было разработано несколько вычислительных инструментов, обеспечивающих высокий уровень контроля над вырожденными кодонами и соответствующими им аминокислотами.[6][7][8]

Вырожденный кодонКол-во кодоновКол-во аминокислотКол-во остановокКодированные аминокислоты
NNN64203Все 20
NNK / NNS32201Все 20
NDT12120RNDCGHILFSYV
БРК18120ARCGILMFSTWV
NRT880RNDCGHSY

Приложения

Насыщенный мутагенез обычно используется для создания вариантов направленная эволюция.[9][10]

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ а б c Reetz, M. T .; Карбаллейра Дж. Д. (2007). «Итерационный мутагенез насыщения (ISM) для быстрой направленной эволюции функциональных ферментов». Протоколы природы. 2 (4): 891–903. Дои:10.1038 / nprot.2007.72. PMID  17446890.
  2. ^ Чжэн, Лэй; Бауманн, Ульрих; Реймон, Жан-Луи (2004-07-15). «Эффективный одноэтапный протокол сайт-направленного и сайт-насыщенного мутагенеза». Исследования нуклеиновых кислот. 32 (14): e115. Дои:10.1093 / нар / gnh110. ISSN  0305-1048. ЧВК  514394. PMID  15304544.
  3. ^ Reetz, Manfred T .; Прасад, Шринатх; Carballeira, José D .; Гумуля, Йосефин; Бокола, Марко (07.07.2010). «Итерационный мутагенез насыщения ускоряет лабораторную эволюцию стереоселективности ферментов: строгое сравнение с традиционными методами». Журнал Американского химического общества. 132 (26): 9144–9152. Дои:10.1021 / ja1030479. ISSN  0002-7863. PMID  20536132.
  4. ^ Килле, Сабрина; Асеведо-Роча, Карлос Дж .; Parra, Loreto P .; Чжан, Чжи-Ган; Опперман, Дидерик Дж .; Reetz, Manfred T .; Асеведо, Хуан Пабло (15 февраля 2013 г.). «Снижение избыточности кодонов и усилия по скринингу комбинаторных библиотек белков, созданных с помощью мутагенеза насыщения». Синтетическая биология ACS. 2 (2): 83–92. Дои:10.1021 / sb300037w. PMID  23656371.
  5. ^ Тан, Ликсия; Ван, Сюн; Ру, Бэйбэй; Сунь, Хэнфэй; Хуанг, Цзянь; Гао, Хуэй (июнь 2014 г.). «MDC-Analyzer: новый инструмент проектирования вырожденных праймеров для создания интеллектуальных библиотек мутагенеза с смежными сайтами». Биотехнологии. 56 (6): 301–302, 304, 306–308, пасс. Дои:10.2144/000114177. ISSN  1940-9818. PMID  24924390.
  6. ^ Halweg-Edwards, Andrea L .; Сосны, Гур; Винклер, Джеймс Д .; Сосны, Ассаф; Гилл, Райан Т. (16 сентября 2016 г.). «Веб-интерфейс для сжатия кодонов». Синтетическая биология ACS. 5 (9): 1021–1023. Дои:10.1021 / acssynbio.6b00026. ISSN  2161-5063. PMID  27169595.
  7. ^ Энгквист, Мартин К. М .; Нильсен, Йенс (30 апреля 2015 г.). «ANT: программное обеспечение для генерации и оценки вырожденных кодонов для естественных и расширенных генетических кодов». Синтетическая биология ACS. 4 (8): 935–938. Дои:10.1021 / acssynbio.5b00018. PMID  25901796.
  8. ^ Келл, Дуглас Б.; День, Филип Дж .; Брейтлинг, Райнер; Грин, Люси; Каррин, Эндрю; Суэйнстон, Нил (10.07.2017). «CodonGenie: оптимизированные инструменты для разработки неоднозначных кодонов». PeerJ Компьютерные науки. 3: e120. Дои:10.7717 / peerj-cs.120. ISSN  2376-5992.
  9. ^ Чика, Роберт А .; и другие. (2005). «Полурациональные подходы к инженерии ферментной активности: сочетание преимуществ направленной эволюции и рационального дизайна». Текущее мнение в области биотехнологии. 16 (4): 378–384. Дои:10.1016 / j.copbio.2005.06.004. PMID  15994074.
  10. ^ Shivange, Amol V; Мариенхаген, Ян; Мундхада, Хеманшу; Шенк, Александр; Шванеберг, Ульрих (2009-02-01). «Достижения в создании функционального разнообразия для направленной эволюции белка». Современное мнение в области химической биологии. Биокатализ и биотрансформация / Биоинорганическая химия. 13 (1): 19–25. Дои:10.1016 / j.cbpa.2009.01.019. PMID  19261539.