Белковая инженерия - Protein engineering

Белковая инженерия это процесс разработки полезных или ценных белки. Это молодая дисциплина, в которой проводится много исследований для понимания сворачивание белка и признание белковый дизайн принципы. Это также рынок продуктов и услуг, оценочная стоимость которого к 2017 году составит 168 миллиардов долларов.^[1]

Существует две основные стратегии белковой инженерии: рациональный белковый дизайн и направленная эволюция. Эти методы не исключают друг друга; исследователи часто применяют и то, и другое. В дальнейшем более детальное знание структура белка и функция, и прогресс в высокопроизводительный скрининг, может значительно расширить возможности белковой инженерии. В конце концов, даже неприродные аминокислоты могут быть включены с помощью более новых методов, таких как расширенный генетический код, которые позволяют кодировать новые аминокислоты в генетическом коде.

Подходы

Рациональный дизайн

В рациональном дизайне белка ученый использует подробные знания структуры и функции белка, чтобы внести желаемые изменения. В общем, это недорогое и технически простое преимущество, поскольку сайт-направленный мутагенез методы хорошо разработаны. Однако его главный недостаток заключается в том, что подробные структурные сведения о белке часто недоступны, и, даже если они доступны, может быть очень сложно предсказать эффекты различных мутаций, поскольку структурная информация чаще всего дает статическую картину структуры белка. Однако такие программы, как Складной @ дома и Сложите его использовали краудсорсинг методы, чтобы понять мотивы сворачивания белков.^[2]

Вычислительный дизайн белка алгоритмы стремятся идентифицировать новые аминокислотные последовательности, которые имеют низкую энергию при свертывании до заранее заданной целевой структуры. В то время как пространство конформации последовательностей, которое необходимо найти, велико, наиболее сложным требованием для компьютерного дизайна белка является быстрая, но точная функция энергии, которая может отличать оптимальные последовательности от подобных субоптимальных.

Множественное выравнивание последовательностей

Без структурной информации о белке анализ последовательности часто полезен для выяснения информации о белке. Эти методы включают выравнивание последовательностей целевого белка с последовательностями других родственных белков. Это выравнивание может показать, какие аминокислоты являются консервативными у разных видов и важны для функции белка. Эти анализы могут помочь идентифицировать горячие точки аминокислот, которые могут служить сайтами-мишенями для мутаций. Множественное выравнивание последовательностей использует базы данных, такие как PREFAB, SABMARK, OXBENCH, IRMBASE и BALIBASE, для перекрестной ссылки последовательностей целевого белка с известными последовательностями. Ниже перечислены методы множественного выравнивания последовательностей.^{[3][страница нужна ]}

Этот метод начинается с выполнения попарного выравнивания последовательностей с использованием k-кортеж или же Нидлман – Вунш методы. Эти методы вычисляют матрицу, которая отображает попарное сходство между парами последовательностей. Затем оценки сходства преобразуются в оценки расстояния, которые используются для создания направляющего дерева с использованием метода соединения соседей. Это направляющее дерево затем используется для получения множественного выравнивания последовательностей.^{[3][страница нужна ]}

Кустал омега

Этот метод позволяет выровнять до 190 000 последовательностей с помощью метода k-кортежей. Следующие последовательности группируются с использованием mBed и k-средства методы. Затем строится направляющее дерево с использованием UPGMA метод, который используется пакетом HH align. Это направляющее дерево используется для генерации нескольких выравниваний последовательностей.^{[3][страница нужна ]}

MAFFT

Этот метод использует быстрое преобразование Фурье (БПФ), которое преобразует аминокислотные последовательности в последовательность, состоящую из значений объема и полярности для каждого аминокислотного остатка. Эта новая последовательность используется для поиска гомологичных областей.^{[3][страница нужна ]}

K-Align

В этом методе используется алгоритм приблизительного сопоставления строк Ву-Манбера для создания нескольких сопоставлений последовательностей.^{[3][страница нужна ]}

Сравнение множественных последовательностей по логарифмическому ожиданию (MUSCLE)

Этот метод использует расстояния Кмера и Кимуры для генерации множественных выравниваний последовательностей.^{[3][страница нужна ]}

Т-кофе

Этот метод использует целевые функции согласованности на основе дерева для эволюции согласования. Было показано, что этот метод на 5-10% точнее, чем Clustal W.^{[3][страница нужна ]}

Коэволюционный анализ

Коэволюционный анализ также известен как коррелированная мутация, ковариация или совместная замена. Этот тип рационального дизайна включает в себя взаимные эволюционные изменения в эволюционно взаимодействующих локусах. Обычно этот метод начинается с генерации тщательно подобранных сравнений нескольких последовательностей для целевой последовательности. Это выравнивание затем подвергается ручному уточнению, которое включает удаление последовательностей с большим количеством пробелов, а также последовательностей с низкой идентичностью последовательностей. Этот шаг повышает качество выравнивания. Затем обработанное вручную выравнивание используется для дальнейших коэволюционных измерений с использованием различных алгоритмов коррелированных мутаций. Эти алгоритмы приводят к матрице оценки коэволюции. Эта матрица фильтруется путем применения различных тестов значимости для извлечения значимых значений коэволюции и устранения фонового шума. Коэволюционные измерения дополнительно оцениваются для оценки их эффективности и точности. Наконец, результаты этого коэволюционного анализа подтверждаются экспериментально.^{[3][страница нужна ]}

Структурное прогнозирование

De novo синтез белка извлекает выгоду из знания существующих белковых структур. Это знание существующей структуры белка помогает предсказывать новые структуры белка. Методы прогнозирования структуры белков относятся к одному из четырех следующих классов: ab initio, методы на основе фрагментов, моделирование гомологии и распределение белков.^{[3][страница нужна ]}

Ab initio

Эти методы включают бесплатное моделирование без использования какой-либо структурной информации о шаблоне. Ab initio Методы направлены на предсказание нативных структур белков, соответствующих глобальному минимуму его свободной энергии. несколько примеров ab initio методы: AMBER, GROMOS, GROMACS, CHARMM, OPLS и ENCEPP12. Общие шаги для ab initio методы начинаются с геометрического представления интересующего белка. Затем разрабатывается модель функции потенциальной энергии для белка. Эта модель может быть создана с использованием потенциалов молекулярной механики или потенциальных функций, полученных из структуры белка. После разработки потенциальной модели к белку применяются методы поиска энергии, включая молекулярно-динамическое моделирование, моделирование методом Монте-Карло и генетические алгоритмы.^{[3][страница нужна ]}

На основе фрагментов

Эти методы используют информацию из базы данных о структурах для сопоставления гомологичных структур созданным последовательностям белков. Эти гомологичные структуры собираются для получения компактных структур с использованием процедур оценки и оптимизации с целью достижения наименьшего показателя потенциальной энергии. Веб-серверы для фрагментной информации: I-TASSER, ROSETTA, ROSETTA @ home, FRAGFOLD, CABS fold, PROFESY, CREF, QUARK, UNDERTAKER, HMM и ANGLOR.^[3]:72

Гомологическое моделирование

Эти методы основаны на гомологии белков. Эти методы также известны как сравнительное моделирование. Первым шагом в моделировании гомологии обычно является идентификация шаблонных последовательностей известной структуры, которые гомологичны запрашиваемой последовательности. Затем последовательность запроса выравнивается с последовательностью шаблона. После выравнивания структурно консервативные области моделируются с использованием структуры шаблона. Затем следует моделирование боковых цепей и петель, отличных от шаблона. В итоге смоделированная конструкция проходит доработку и оценку качества. Серверы, доступные для данных моделирования гомологии, перечислены здесь: SWISS MODEL, MODELLER, ReformAlign, PyMOD, TIP-STRUCTFAST, COMPASS, 3d-PSSM, SAMT02, SAMT99, HHPRED, FAGUE, 3D-JIGSAW, META-PP, ROSETTA и И-ТАССЕР.^{[3][страница нужна ]}

Протеиновая нить

Продувка белков может использоваться, когда не может быть найден надежный гомолог для запрашиваемой последовательности. Этот метод начинается с получения последовательности запроса и библиотеки шаблонных структур. Затем последовательность запросов распределяется по известным шаблонным структурам. Эти модели-кандидаты оцениваются с использованием функций оценки. Они оцениваются на основе моделей потенциальной энергии как запроса, так и последовательности шаблонов. Затем выбирается соответствие с моделью с наименьшей потенциальной энергией. Способы и серверы для получения данных потоковой передачи и выполнения вычислений перечислены здесь: GenTHREADER, pGenTHREADER, pDomTHREADER, ORFEUS, PROSPECT, BioShell-Threading, FFASO3, RaptorX, HHPred, LOOPP server, Sparks-X, SEGMER, THREADER3D, ESYPREDITS , RAPTOR, COTH, MUSTER.^{[3][страница нужна ]}

Для получения дополнительной информации о рациональном дизайне см. сайт-направленный мутагенез.

Направленная эволюция

В направленной эволюции случайные мутагенез, например к подверженная ошибкам ПЦР или же мутагенез с насыщением последовательности, применяется к белку, и режим отбора используется для выбора вариантов, имеющих желаемые признаки. Затем применяются дополнительные раунды мутации и отбора. Этот метод имитирует естественный эволюция и, в целом, дает лучшие результаты по сравнению с рациональным дизайном. Дополнительный процесс, называемый Перетасовка ДНК, смешивает и сопоставляет части успешных вариантов для достижения лучших результатов. Такие процессы имитируют рекомбинация что происходит естественно во время половое размножение. Преимущества направленной эволюции заключаются в том, что она не требует предварительных структурных знаний о протеине и не требует возможности предсказать, какой эффект будет иметь данная мутация. В самом деле, результаты экспериментов по направленной эволюции часто удивительны, поскольку желаемые изменения часто вызываются мутациями, от которых не ожидается какого-либо эффекта. Недостаток в том, что они требуют высокопроизводительный скрининг, что возможно не для всех белков. Большое количество рекомбинантная ДНК должны быть видоизменены, а продукты проверены на предмет выявления желаемых признаков. Большое количество вариантов часто требует дорогостоящего робототехнического оборудования для автоматизации процесса. Кроме того, не все желаемые действия можно легко отследить.

В лаборатории можно эффективно имитировать естественную дарвиновскую эволюцию, чтобы адаптировать свойства белка для различных применений, включая катализ. Существует множество экспериментальных технологий для создания больших и разнообразных библиотек белков и для скрининга или выбора свернутых функциональных вариантов. Свернутые белки неожиданно часто возникают в пространстве случайных последовательностей, что можно использовать при разработке селективных связывающих веществ и катализаторов. Будучи более консервативным, чем прямой отбор из глубокого пространства последовательностей, изменение конструкции существующих белков с помощью случайного мутагенеза и отбора / скрининга является особенно надежным методом оптимизации или изменения существующих свойств. Он также представляет собой отличную отправную точку для достижения более амбициозных инженерных целей. Соединение экспериментальной эволюции с современными вычислительными методами, вероятно, является самой широкой и наиболее плодотворной стратегией создания функциональных макромолекул, неизвестных природе.^[4]

Основные проблемы разработки высококачественных мутантных библиотек показали значительный прогресс в недавнем прошлом. Этот прогресс проявился в форме лучшего описания эффектов мутационных нагрузок на свойства белков. Кроме того, вычислительные подходы продемонстрировали значительный прогресс в области неисчислимого большого пространства последовательностей до более управляемых размеров, которые можно отсеивать, что позволило создать интеллектуальные библиотеки мутантов. Размер библиотеки также был уменьшен до большего размера, пригодного для скрининга, за счет идентификации ключевых полезных остатков с использованием алгоритмов систематической рекомбинации. Наконец, значительный шаг вперед к эффективному реинжинирингу ферментов был сделан с разработкой более точных статистических моделей и алгоритмов количественной оценки и прогнозирования сопряженных мутационных эффектов на функции белков.^[5]

В целом направленную эволюцию можно суммировать как итеративный двухэтапный процесс, который включает создание библиотек мутантных белков и высокопроизводительные процессы скрининга для отбора вариантов с улучшенными характеристиками. Этот метод не требует предварительного знания структуры белка и взаимосвязи функций. Направленная эволюция использует случайный или сфокусированный мутагенез для создания библиотек мутантных белков. Случайные мутации могут быть введены с использованием либо подверженной ошибкам ПЦР, либо мутагенеза с насыщением сайтов. Мутанты также могут быть получены с использованием рекомбинации нескольких гомологичных генов. Природа выработала ограниченное количество полезных последовательностей. Направленная эволюция позволяет идентифицировать неоткрытые белковые последовательности, которые выполняют новые функции. Эта способность зависит от способности белков терпимо относиться к заменам аминокислотных остатков без ущерба для укладки или стабильности.^{[3][страница нужна ]}

Методы направленной эволюции можно условно разделить на две стратегии: асексуальные и половые методы.

Бесполые методы

Бесполые методы не создают перекрестных связей между родительскими генами. Отдельные гены используются для создания мутантных библиотек с использованием различных мутагенных методов. Эти бесполые методы могут приводить к случайному или целенаправленному мутагенезу.

Случайный мутагенез

Случайные мутагенные методы вызывают случайные мутации по всему интересующему гену. Случайный мутагенез может вызывать следующие типы мутаций: переходы, трансверсии, вставки, делеции, инверсии, бессмысленность и бессмыслица. Примеры способов получения случайного мутагенеза приведены ниже.

Подверженная ошибкам ПЦР

ПЦР, подверженная ошибкам, использует тот факт, что ДНК-полимераза Taq не обладает 3'-5'-экзонуклеазной активностью. Это приводит к частоте ошибок 0,001-0,002% на нуклеотид на репликацию. Этот метод начинается с выбора гена или участка в гене, который нужно мутировать. Затем рассчитывается степень требуемой ошибки на основе типа и степени активности, которую необходимо произвести. Эта степень ошибки определяет подходящую стратегию ПЦР, подверженную ошибкам. После ПЦР гены клонируют в плазмиду и вводят в компетентные клеточные системы. Затем эти клетки проверяются на наличие желаемых признаков. Затем выделяют плазмиды для колоний, которые демонстрируют улучшенные характеристики, и затем используют в качестве матриц на следующем этапе мутагенеза. ПЦР, подверженная ошибкам, показывает смещения одних мутаций по сравнению с другими. Например, смещения для переходов по трансверсиям.^{[3][страница нужна ]}

Уровень ошибок при ПЦР можно увеличить следующими способами:^{[3][страница нужна ]}

1. Увеличьте концентрацию хлорида магния, который стабилизирует некомплементарные пары оснований.
2. Добавьте хлорид марганца, чтобы снизить специфичность пары оснований.
3. Повышенное и несбалансированное добавление дНТФ.
4. Добавление аналогов оснований, таких как dITP, 8 oxo-dGTP и dPTP.
5. Увеличьте концентрацию полимеразы Taq.
6. Увеличьте время продления.
7. Увеличьте время цикла.
8. Используйте менее точную полимеразу Taq.

Также см полимеразной цепной реакции для дополнительной информации.

ПЦР, подверженная ошибкам

Этот метод ПЦР основан на амплификации по катящемуся кругу, которая моделируется методом, который бактерии используют для амплификации кольцевой ДНК. Этот метод приводит к линейным дуплексам ДНК. Эти фрагменты содержат тандемные повторы кольцевой ДНК, называемые конкатамерами, которые можно трансформировать в бактериальные штаммы. Мутации вводятся путем сначала клонирования целевой последовательности в подходящую плазмиду. Затем процесс амплификации начинается с использованием случайных гексамерных праймеров и ДНК-полимеразы Ф29 в условиях амплификации, подверженной ошибкам. Дополнительные условия для получения подверженной ошибкам амплификации по типу катящегося круга: 1,5 пМ матричной ДНК, 1,5 мМ MnCl.₂ и время реакции 24 часа. MnCl₂ добавляется в реакционную смесь, чтобы способствовать случайным точечным мутациям в цепях ДНК. Скорость мутации можно увеличить, увеличив концентрацию MnCl.₂, или уменьшая концентрацию матричной ДНК. Амплификация по типу «катящегося круга», подверженная ошибкам, выгодна по сравнению с подверженной ошибкам ПЦР, поскольку в ней используются универсальные случайные гексамерные праймеры, а не специфические праймеры. Также продукты реакции этой амплификации не нужно обрабатывать лигазами или эндонуклеазами. Эта реакция изотермическая.^{[3][страница нужна ]}

Химический мутагенез

Химический мутагенез включает использование химических агентов для введения мутаций в генетические последовательности. Примеры химических мутагенов приведены ниже.

Бисульфат натрия эффективен при мутации геномных последовательностей, богатых G / C. Это связано с тем, что бисульфат натрия катализирует дезаминирование неметилированного цитозина до урацила.^{[3][страница нужна ]}

Этилметансульфонат алкилирует остатки гуанидина. Это изменение вызывает ошибки во время репликации ДНК.^{[3][страница нужна ]}

Азотистая кислота вызывает трансверсию путем деаминирования аденина и цитозина.^{[3][страница нужна ]}

Двойной подход к случайному химическому мутагенезу представляет собой итеративный двухэтапный процесс. Во-первых, это касается in vivo химический мутагенез интересующего гена с помощью EMS. Затем обработанный ген выделяют и клонируют в необработанный вектор экспрессии, чтобы предотвратить мутации в остове плазмиды.^{[3][страница нужна ]} Этот метод сохраняет генетические свойства плазмид.^{[3][страница нужна ]}

Нацеливание гликозилаз на встроенные массивы для мутагенеза (TaGTEAM)

Этот метод использовался для создания целевых in vivo мутагенез у дрожжей. Этот метод включает слияние 3-метиладенин-ДНК-гликозилазы с ДНК-связывающим доменом tetR. Было показано, что это увеличивает частоту мутаций более чем в 800 раз в областях генома, содержащих сайты tetO.^{[3][страница нужна ]}

Мутагенез путем случайной вставки и удаления

Этот метод предполагает изменение длины последовательности путем одновременного удаления и вставки фрагментов оснований произвольной длины. Было показано, что этот метод позволяет получать белки с новыми функциями за счет введения новых сайтов рестрикции, специфических кодонов, четырех основных кодонов для неприродных аминокислот.^{[3][страница нужна ]}

Случайный мутагенез на основе транспозонов

Недавно было сообщено о многих методах случайного мутагенеза на основе транспозонов. Эти методы включают, но не ограничиваются следующим: случайная циклическая перестановка PERMUTE, случайное усечение белка, случайная замена триплетов нуклеотидов, случайная вставка домена / тега / нескольких аминокислот, мутагенез со сканированием кодонов и мутагенез со сканированием нескольких кодонов. Все эти вышеупомянутые методы требуют создания транспозонов mini-Mu. Компания Thermo Scientific производит наборы для создания этих транспозонов.^{[3][страница нужна ]}

Методы случайного мутагенеза, изменяющие длину целевой ДНК

Эти методы включают изменение длины гена с помощью инсерционных и делеционных мутаций. Примером является метод тандемной повторной вставки (TRINS). Этот метод приводит к генерации тандемных повторов случайных фрагментов целевого гена посредством амплификации катящегося круга и одновременного включения этих повторов в целевой ген.^{[3][страница нужна ]}

Штаммы-мутаторы

Штаммы-мутаторы представляют собой линии бактериальных клеток, в которых отсутствует один или несколько механизмов репарации ДНК. Примером мутаторной цепи является E. coli XL1-RED.^{[3][страница нужна ]} Этот подчиненный штамм E. coli не имеет путей репарации ДНК MutS, MutD, MutT. Использование штаммов-мутаторов полезно при введении многих типов мутаций; однако эти штаммы демонстрируют прогрессирующую болезнь культуры из-за накопления мутаций в собственном геноме штаммов.^{[3][страница нужна ]}

Целенаправленный мутагенез

Целенаправленные мутагенные методы вызывают мутации в заранее определенных аминокислотных остатках. Эти методы требуют понимания взаимосвязи «последовательность-функция» для интересующего белка. Понимание этой взаимосвязи позволяет идентифицировать остатки, которые важны для стабильности, стереоселективности и каталитической эффективности.^{[3][страница нужна ]} Примеры методов, которые производят сфокусированный мутагенез, приведены ниже.

Мутагенез насыщения сайта

Мутагенез с насыщением сайта - это метод на основе ПЦР, используемый для нацеливания на аминокислоты, играющие важную роль в функции белков. Двумя наиболее распространенными методами для выполнения этого являются одиночная ПЦР для всей плазмиды и ПЦР с перекрывающимся удлинением.

Одинарная ПЦР цельной плазмиды также называется сайт-направленным мутагенезом (SDM). Продукты SDM подвергаются расщеплению эндонуклеазой Dpn. Это расщепление приводит к расщеплению только родительской цепи, поскольку родительская цепь содержит GmATC, который метилирован по N6 аденина. SDM плохо работает для больших плазмид размером более десяти тысяч оснований. Кроме того, этот метод позволяет заменять только два нуклеотида за раз.^{[3][страница нужна ]}

ПЦР с удлинением перекрывания требует использования двух пар праймеров. Один праймер в каждом наборе содержит мутацию. Выполняется первый раунд ПЦР с использованием этих наборов праймеров, и образуются два дуплекса двухцепочечной ДНК. Затем выполняется второй раунд ПЦР, в котором эти дуплексы денатурируются и снова отжигаются с набором праймеров для получения гетеродуплексов, в каждой цепи которых есть мутация. Любые пробелы в этих вновь образованных гетеродуплексах заполняются ДНК-полимеразами и далее амплифицируются.^{[3][страница нужна ]}

Мутагенез с насыщением последовательностей (SeSaM)

Мутагенез с насыщением последовательностей приводит к рандомизации целевой последовательности в каждом нуклеотидном положении. Этот метод начинается с создания фрагментов ДНК переменной длины с универсальными основаниями с помощью матричных трансфераз на 3'-концах. Затем эти фрагменты растягиваются до полной длины с использованием однонитевого шаблона. Универсальные основания заменяются случайными стандартными основаниями, вызывая мутации. Существует несколько модифицированных версий этого метода, таких как SeSAM-Tv-II, SeSAM-Tv + и SeSAM-III.^{[3][страница нужна ]}

Параллельные реакции с одним праймером (SPRINP)

Этот метод мутагенеза с насыщением сайтов включает две отдельные реакции ПЦР. В первой из них используются только прямые праймеры, а во второй реакции используются только обратные праймеры. Это позволяет избежать образования димеров праймера.^{[3][страница нужна ]}

Мега праймированный и безлигазный сфокусированный мутагенез

Этот метод мутагенного насыщения сайтов начинается с одного мутагенного олигонуклеотида и одного универсального фланкирующего праймера. Эти два реагента используются для начального цикла ПЦР. Продукты из этого первого цикла ПЦР используются в качестве мега-праймеров для следующей ПЦР.^{[3][страница нужна ]}

Ω-ПЦР

Этот мутагенный метод насыщения сайтов основан на ПЦР с расширением перекрывания. Он используется для введения мутаций в любой сайт кольцевой плазмиды.^{[3][страница нужна ]}

PFunkel-ominchange-OSCARR

Этот метод использует определенный пользователем сайт-направленный мутагенез одновременно в одном или нескольких сайтах. OSCARR - это аббревиатура от One Pot Simple Methodology for Cassette Randomization and Recombination. Эта рандомизация и рекомбинация приводят к рандомизации желаемых фрагментов белка. Omnichange - это независимый от последовательности многоузловой мутагенез с насыщением, который может насыщать до пяти независимых кодонов в гене.

Мутагенез тример-димер

Этот метод удаляет избыточные кодоны и стоп-кодоны.

Кассетный мутагенез

Это метод на основе ПЦР. Кассетный мутагенез начинается с синтеза кассеты ДНК, содержащей интересующий ген, который фланкирован с обеих сторон сайтами рестрикции. Эндонуклеаза, которая расщепляет эти сайты рестрикции, также расщепляет сайты в целевой плазмиде. Кассету ДНК и плазмиду-мишень обрабатывают эндонуклеазами для расщепления этих сайтов рестрикции и создания липких концов. Затем продукты этого расщепления лигируют вместе, что приводит к встраиванию гена в плазмиду-мишень. Альтернативная форма кассетного мутагенеза, называемая комбинаторным кассетным мутагенезом, используется для определения функций отдельных аминокислотных остатков в интересующем белке. Рекурсивный ансамблевой мутагенез затем использует информацию из предыдущего комбинаторного кассетного мутагенеза. Кассетный мутагенез кодонов позволяет вставлять или заменять одиночный кодон в определенном месте в двухцепочечной ДНК.^{[3][страница нужна ]}

Сексуальные методы

Сексуальные методы направленной эволюции включают in vitro рекомбинации, имитирующие естественные in vivo рекомбинация. Обычно эти методы требуют высокой гомологии последовательностей между родительскими последовательностями. Эти методы часто используются для рекомбинации двух разных родительских генов, и эти методы действительно создают кроссоверы между этими генами.^{[3][страница нужна ]}

В пробирке гомологичная рекомбинация

Гомологичную рекомбинацию можно разделить на следующие категории: in vivo или же in vitro. В пробирке гомологичная рекомбинация имитирует естественный in vivo рекомбинация. Эти in vitro Способы рекомбинации требуют высокой гомологии последовательностей между родительскими последовательностями. Эти методы используют естественное разнообразие родительских генов, рекомбинируя их для получения химерных генов. Полученные химеры демонстрируют смесь родительских характеристик.^{[3][страница нужна ]}

Перетасовка ДНК

Этот in vitro техника была одной из первых техник в эпоху рекомбинации. Он начинается с расщепления гомологичных родительских генов на небольшие фрагменты ДНКазой1. Эти небольшие фрагменты затем очищаются от непереваренных родительских генов. Затем очищенные фрагменты снова собирают с использованием ПЦР без праймера. В этой ПЦР участвуют гомологичные фрагменты из разных родительских генов, примирующие друг друга, в результате чего получается химерная ДНК. Затем химерную ДНК родительского размера амплифицируют с использованием концевых праймеров в обычной ПЦР.^{[3][страница нужна ]}

Случайная заливка В пробирке рекомбинация (RPR)

Этот in vitro Метод гомологичной рекомбинации начинается с синтеза множества коротких фрагментов генов, демонстрирующих точечные мутации, с использованием праймеров со случайной последовательностью. Эти фрагменты повторно собирают до полноразмерных родительских генов с помощью беспраймерной ПЦР. Эти повторно собранные последовательности затем амплифицируют с помощью ПЦР и подвергают дальнейшим процессам отбора. Этот метод выгоден по сравнению с перетасовкой ДНК, потому что в нем не используется ДНКаза1, поэтому нет предвзятости для рекомбинации рядом с пиримидиновым нуклеотидом. Этот метод также выгоден благодаря использованию синтетических случайных праймеров, которые имеют одинаковую длину и не содержат систематических ошибок. Наконец, этот метод не зависит от длины последовательности матрицы ДНК и требует небольшого количества родительской ДНК.^{[3][страница нужна ]}

Усеченная метагеномная ген-специфическая ПЦР

Этот метод генерирует химерные гены непосредственно из метагеномных образцов. Он начинается с выделения желаемого гена путем функционального скрининга из образца метагеномной ДНК. Затем конструируются специфические праймеры, которые используются для амплификации гомологичных генов из различных образцов окружающей среды. Наконец, создаются химерные библиотеки для извлечения желаемых функциональных клонов путем перетасовки этих амплифицированных гомологичных генов.^{[3][страница нужна ]}

Поэтапный процесс продления (StEP)

Этот in vitro Метод основан на переключении шаблона для генерации химерных генов. Этот основанный на ПЦР метод начинается с начальной денатурации матрицы, за которой следует отжиг праймеров и короткое время удлинения. Все последующие циклы вызывают отжиг между короткими фрагментами, созданными в предыдущих циклах, и различными частями шаблона. Эти короткие фрагменты и шаблоны отжигаются вместе на основе комплементарности последовательностей. Этот процесс отжига фрагментов ДНК-матрицы известен как переключение матрицы. Эти отожженные фрагменты затем будут служить праймерами для дальнейшего удлинения. Этот метод проводят до тех пор, пока не будет получена последовательность химерного гена родительской длины. Выполнение этого метода требует только начала фланкирующих праймеров. Также нет необходимости в ферменте ДНКаза1.^{[3][страница нужна ]}

Случайный химерагенез на временных шаблонах (RACHITT)

Было показано, что этот метод позволяет генерировать библиотеки химерных генов со средним числом кроссоверов 14 на химерный ген. Он начинается с выравнивания фрагментов родительской верхней цепи с нижней цепью урацил-содержащей матрицы из гомологичного гена. 5 'и 3' выступающие створки расщепляются, а промежутки заполняются экзонуклеазной и эндонуклеазной активностями ДНК-полимераз Pfu и taq. Затем матрицу, содержащую урацил, удаляют из гетеродуплекса обработкой урацил-ДНК-гликозилазой с последующей амплификацией с помощью ПЦР. Этот метод выгоден тем, что он генерирует химеры с относительно высокой частотой кроссовера. Однако он несколько ограничен из-за сложности и необходимости создания одноцепочечной ДНК и одноцепочечной матричной ДНК, содержащей урацил.^{[3][страница нужна ]}

Синтетическая перетасовка

Перестановка синтетических вырожденных олигонуклеотидов добавляет гибкости методам перестановки, поскольку могут быть включены олигонуклеотиды, содержащие оптимальные кодоны и полезные мутации.^{[3][страница нужна ]}

В естественных условиях Гомологичная рекомбинация

Клонирование, выполняемое в дрожжах, включает зависимую от ПЦР повторную сборку фрагментированных векторов экспрессии. Эти повторно собранные векторы затем вводятся и клонируются в дрожжах. Использование дрожжей для клонирования вектора позволяет избежать токсичности и встречного отбора, которые могут возникнуть в результате лигирования и размножения в E. coli.^{[3][страница нужна ]}

Мутагенный процесс организованной рекомбинации гомологичными in vivo группировка (MORPHING)

Этот метод вводит мутации в определенные области генов, оставляя другие части нетронутыми, используя высокую частоту гомологичной рекомбинации у дрожжей.^{[3][страница нужна ]}

Непрерывная эволюция с помощью фагов (PACE)

В этом методе используется бактериофаг с измененным жизненным циклом для передачи развивающихся генов от хозяина к хозяину. Жизненный цикл фага устроен таким образом, что перенос коррелирует с интересующей активностью фермента. Этот метод выгоден тем, что требует минимального вмешательства человека для непрерывной эволюции гена.^[3]

В пробирке негомологичные методы рекомбинации

Эти методы основаны на том факте, что белки могут демонстрировать сходную структурную идентичность, но не обладают гомологией последовательностей.

Перетасовка экзонов

Перестановка экзонов - это комбинация экзонов из разных белков в результате событий рекомбинации, происходящих в интронах. Перетасовка ортологичных экзонов включает объединение экзонов из ортологичных генов разных видов. Перетасовка ортологичных доменов включает перетасовку целых белковых доменов из ортологичных генов разных видов. Паралогичная перетасовка экзонов включает перетасовку экзонов из разных генов одного и того же вида. Перетасовка паралоговых доменов включает перетасовку целых белковых доменов из паралогичных белков одного и того же вида. Функциональная перетасовка гомологов включает перетасовку негомологичных доменов, которые функционально связаны. Все эти процессы связаны с амплификацией желаемых экзонов из разных генов с использованием химерных синтетических олигонуклеотидов. Эти продукты амплификации затем повторно собираются в гены полной длины с использованием ПЦР без праймера. Во время этих циклов ПЦР фрагменты действуют как матрицы и праймеры. В результате получаются химерные полноразмерные гены, которые затем подвергаются скринингу.^{[3][страница нужна ]}

Инкрементное усечение для создания гибридных ферментов (ITCHY)

Фрагменты родительских генов создаются с использованием контролируемого переваривания экзонуклеазой III. Эти фрагменты притупляются с помощью эндонуклеазы и лигируются для получения гибридных генов. THIOITCHY - это модифицированная технология ITCHY, в которой используются аналоги нуклеотидтрифосфата, такие как α-фосфотиоатные дНТФ. Включение этих нуклеотидов блокирует переваривание экзонуклеазой III. Это ингибирование переваривания экзонуклеазой III называется пиковым. Пикирование может быть выполнено путем усечения генов с помощью экзонуклеазы для создания фрагментов с короткими одноцепочечными выступами. Эти фрагменты затем служат в качестве матриц для амплификации ДНК-полимеразой в присутствии небольших количеств фосфотиоатных дНТФ. Эти полученные фрагменты затем лигируют вместе с образованием полноразмерных генов. В качестве альтернативы интактные родительские гены можно амплифицировать с помощью ПЦР в присутствии нормальных dNTP и фосфотиоатных dNTP. Эти продукты полноразмерной амплификации затем подвергаются расщеплению экзонуклеазой. Переваривание будет продолжаться до тех пор, пока экзонуклеаза не встретит α-pdNTP, в результате чего будут получены фрагменты разной длины. Затем эти фрагменты лигируют вместе, чтобы получить химерные гены.^{[3][страница нужна ]}

Царапины

Этот метод генерирует библиотеки гибридных генов, ингибирующих множественные кроссоверы, путем комбинирования перетасовки ДНК и ITCHY. Этот метод начинается с создания двух независимых библиотек ITCHY. Первый с геном А на N-конце. А другой - с геном B на N-конце. Эти фрагменты гибридного гена разделяют либо с использованием переваривания рестриктазой, либо с помощью ПЦР с концевыми праймерами с помощью электрофореза в агарозном геле. Эти изолированные фрагменты затем смешивают и дополнительно расщепляют с помощью ДНКазы1. Затем расщепленные фрагменты собирают с помощью беспраймерной ПЦР с переключением матрицы.^{[3][страница нужна ]}

Рекомбинированное расширение на усеченных шаблонах (RETT)

Этот метод генерирует библиотеки гибридных генов путем переключения матрицы однонаправленных полинуклеотидов в присутствии одноцепочечных фрагментов ДНК в качестве матриц для химер. Этот метод начинается с получения одноцепочечных фрагментов ДНК путем обратной транскрипции с целевой мРНК. Затем специфичные для генов праймеры отжигают с одноцепочечной ДНК. Затем эти гены удлиняются во время цикла ПЦР. За этим циклом следует переключение матрицы и отжиг коротких фрагментов, полученных в результате более раннего удлинения праймера, на другие одноцепочечные фрагменты ДНК. Этот процесс повторяется до получения полноразмерной одноцепочечной ДНК.^{[3][страница нужна ]}

Рекомбинация белков, не зависящая от гомологии последовательности (SHIPREC)

Этот метод генерирует рекомбинацию между генами с небольшой гомологией последовательностей или без нее. Эти химеры сливаются через линкерную последовательность, содержащую несколько сайтов рестрикции. Затем эта конструкция переваривается с использованием DNase1. Фрагменты затупляются с помощью нуклеазы S1. Эти фрагменты с тупым концом соединяют в кольцевую последовательность путем лигирования. Затем эту кольцевую конструкцию линеаризуют с использованием рестрикционных ферментов, сайты рестрикции которых присутствуют в линкерной области. Это приводит к созданию библиотеки химерных генов, в которой вклад генов на 5'- и 3'-конец будет обратным по сравнению с исходной конструкцией.^{[3][страница нужна ]}

Последовательно-независимый сайт-направленный химерагенез (SISDC)

Этот метод приводит к созданию библиотеки генов с множественными кроссоверами нескольких родительских генов. Этот метод не требует идентичности последовательностей родительских генов. Это действительно требует одной или двух консервативных аминокислот в каждом положении кроссовера. Он начинается с выравнивания родительских последовательностей и идентификации консенсусных областей, которые служат сайтами кроссовера. За этим следует включение определенных тегов, содержащих сайты рестрикции, с последующим удалением тегов путем переваривания с помощью Bac1, в результате чего получают гены со связанными концами. Эти фрагменты генов смешивают и лигируют в соответствующем порядке с образованием химерных библиотек.^{[3][страница нужна ]}

Вырожденная гомодуплексная рекомбинация (DHR)

Этот метод начинается с выравнивания гомологичных генов с последующим выявлением областей полиморфизма. Затем верхняя цепь гена делится на небольшие вырожденные олигонуклеотиды. Нижняя цепь также расщепляется на олигонуклеотиды, которые служат каркасом. Эти фрагменты объединяются в растворе, когда олигонуклеотиды верхней цепи собираются на олигонуклеотиды нижней цепи. Промежутки между этими фрагментами заполняются полимеразой и лигируются.^{[3][страница нужна ]}

Случайная мультирекомбинантная ПЦР (RM-PCR)

Этот метод включает перетасовку множества фрагментов ДНК без гомологии в одной ПЦР. Это приводит к реконструкции полных белков путем сборки модулей, кодирующих различные структурные единицы.^{[3][страница нужна ]}

Удобная для пользователя рекомбинация ДНК (USERec)

Этот метод начинается с амплификации фрагментов генов, которые необходимо рекомбинировать, с использованием дНТФ урацила. Этот раствор для амплификации также содержит праймеры, PfuTurbo и ДНК-полимеразу Cx Hotstart. Затем амплифицированные продукты инкубируют с ферментом USER. Этот фермент катализирует удаление остатков урацила из ДНК, создавая пробелы в одной паре оснований. Фрагменты, обработанные ферментом USER, смешивают и лигируют с использованием ДНК-лигазы Т4 и подвергают расщеплению Dpn1 для удаления ДНК-матрицы. Эти полученные двухцепочечные фрагменты подвергают амплификации с использованием ПЦР и трансформируют в E. coli.^{[3][страница нужна ]}

Перестановка Golden Gate (GGS)

Этот метод позволяет рекомбинировать по меньшей мере 9 различных фрагментов в акцепторном векторе с помощью рестрикционного фермента 2 типа, который разрезает за пределы сайтов рестрикции. Он начинается с субклонирования фрагментов в отдельных векторах для создания фланкирующих последовательностей Bsa1 с обеих сторон. Эти векторы затем расщепляют с использованием рестрикционного фермента типа II Bsa1, который генерирует четыре нуклеотидных однонитевых выступа. Фрагменты с комплементарными выступами гибридизуют и лигируют с использованием ДНК-лигазы Т4. Наконец, эти конструкции затем трансформируют в клетки E. coli, которые проверяют на уровни экспрессии.^{[3][страница нужна ]}

Метод рекомбинации ДНК на основе фосфортиоата (PRTec)

Этот метод можно использовать для рекомбинации структурных элементов или целых белковых доменов. Этот метод основан на химии фосфоротиоатов, которая позволяет специфическое расщепление фосфортиодиэфирных связей. Первый этап процесса начинается с амплификации фрагментов, которые необходимо рекомбинировать вместе с основной цепью вектора. Эта амплификация выполняется с использованием праймеров с фосфоротиолированными нуклеотидами на 5'-концах. Амплифицированные продукты ПЦР расщепляют в этанол-йодном растворе при высоких температурах. Затем эти фрагменты гибридизируются при комнатной температуре и превращаются в E. coli, которая восстанавливает любые зазубрины.^{[3][страница нужна ]}

Интегрон

Эта система основана на системе естественной сайт-специфической рекомбинации в E. coli. Эта система называется интегронной и производит естественную перетасовку генов. Этот метод был использован для конструирования и оптимизации функционального оперона биосинтеза триптофана в trp-дефицитной E.coli путем доставки отдельных кассет рекомбинации или генов trpA-E вместе с регуляторными элементами с интегронной системой.^{[3][страница нужна ]}

Перетасовка на основе Y-лигирования (YLBS)

Этот метод генерирует одноцепочечные цепи ДНК, которые включают одноблочную последовательность на 5 'или 3' конце, комплементарные последовательности в области петли стебля и область D-ветви, служащую сайтом связывания праймера для ПЦР. Эквивалентные количества как 5'-, так и 3'-полуцепей смешивают и образуют гибрид из-за комплементарности в области стебля. Гибриды со свободным фосфорилированным 5'-концом в 3'-полуцепях затем лигируют со свободными 3'-концами в 5'-полунити с использованием ДНК-лигазы Т4 в присутствии 0,1 мМ АТФ. Затем лигированные продукты амплифицируют с помощью двух типов ПЦР для получения продуктов ПЦР до 5 ', половины и до 3'. Эти продукты ПЦР превращаются в одноцепочечные путем связывания авидин-биотин с 5'-концом праймов, содержащих последовательности стебля, которые были мечены биотином. Затем биотинилированные 5'-полунити и небиотинилированные 3'-полунити используются в качестве 5'- и 3'-полуцепей для следующего цикла Y-лигирования.^{[3][страница нужна ]}

Полурациональный дизайн

Полурациональный дизайн использует информацию о последовательности, структуре и функции белков в тандеме с алгоритмами прогнозирования. Вместе они используются для идентификации целевых аминокислотных остатков, которые с наибольшей вероятностью влияют на функцию белка. Мутации этих ключевых аминокислотных остатков создают библиотеки мутантных белков, которые с большей вероятностью обладают улучшенными свойствами.^[6]

Достижения в области полурациональной ферментной инженерии и дизайна ферментов de novo предоставляют исследователям новые мощные и эффективные стратегии манипулирования биокатализаторами. Интеграция подходов, основанных на последовательностях и структурах, в дизайне библиотек оказалась отличным руководством для модернизации ферментов. Как правило, текущие вычислительные de novo и методы модернизации не сравниваются с усовершенствованными вариантами каталитических характеристик. Хотя экспериментальная оптимизация может быть произведена с использованием направленной эволюции, дальнейшее повышение точности предсказаний структуры и большая каталитическая способность будут достигнуты с улучшением алгоритмов проектирования. Дальнейшие функциональные улучшения могут быть включены в будущие модели за счет интеграции динамики белков.^[6]

Биохимические и биофизические исследования, наряду с точной настройкой прогностических структур, будут полезны для экспериментальной оценки функционального значения отдельных конструктивных особенностей. Лучшее понимание этих функциональных возможностей даст обратную связь для улучшения будущих проектов.^[6]

Направленная эволюция, скорее всего, не будет заменена в качестве метода выбора для белковой инженерии, хотя компьютерный дизайн белков коренным образом изменил способ, которым белковая инженерия может управлять биомакромолекулами. Более мелкие, более сфокусированные и функционально богатые библиотеки могут быть созданы с использованием методов, которые включают в себя прогностические структуры для основанной на гипотезах инженерии белков. Новые стратегии проектирования и технические достижения положили начало отходу от традиционных протоколов, таких как направленная эволюция, которая представляет собой наиболее эффективную стратегию для выявления наиболее эффективных кандидатов в специализированных библиотеках. Синтез библиотеки целых генов заменяет протоколы перетасовки и мутагенеза для подготовки библиотеки. Кроме того, вместо монументального скрининга и отбора миллионов кандидатов все чаще применяются высокоспецифичные скрининговые анализы с низкой пропускной способностью. Вместе эти разработки позволят вывести белковую инженерию за пределы направленной эволюции и перейти к практическим, более эффективным стратегиям создания биокатализаторов.^[6]

Методы проверки и отбора

После того, как белок претерпел направленную эволюцию, дизайн рациона или дизайн полу-рациона, библиотеки мутантных белков должны быть проверены, чтобы определить, какие мутанты демонстрируют улучшенные свойства. Методы фагового дисплея - один из вариантов скрининга белков. Этот метод включает слияние генов, кодирующих вариантные полипептиды, с генами белка оболочки фага. Варианты белков, экспрессируемые на поверхности фагов, отбирают путем связывания с иммобилизованными мишенями in vitro. Затем фаги с выбранными вариантами белка амплифицируют в бактериях с последующей идентификацией положительных клонов с помощью иммуноферментного анализа. Затем эти отобранные фаги подвергают секвенированию ДНК.^{[3][страница нужна ]}

Системы отображения на клеточной поверхности также можно использовать для скрининга библиотек мутантных полипептидов. Библиотечные мутантные гены включаются в векторы экспрессии, которые затем трансформируются в соответствующие клетки-хозяева. Эти клетки-хозяева подвергаются дальнейшим высокопроизводительным методам скрининга для идентификации клеток с желаемыми фенотипами.^{[3][страница нужна ]}

Бесклеточные системы отображения были разработаны для использования in vitro перевод белков или бесклеточный перевод. Эти методы включают отображение мРНК, отображение рибосом, отображение ковалентной и нековалентной ДНК и in vitro компартментализация.^[3]:53

Ферментная инженерия

Ферментная инженерия - это применение модификации структуры фермента (и, следовательно, его функции) или модификации каталитической активности изолированного ферменты для производства новых метаболитов, чтобы позволить новым (катализируемым) путям протекания реакций,^[7] или преобразовать одни соединения в другие (биотрансформация ). Эти продукты используются в качестве химикатов, фармацевтических препаратов, топлива, пищевых продуктов или сельскохозяйственных добавок.

An ферментный реактор ^[8] состоит из сосуда, содержащего реакционную среду, которая используется для выполнения желаемого преобразования ферментативными средствами. Ферменты, используемые в этом процессе, не содержатся в растворе.

Примеры сконструированных белков

Вычислительные методы были использованы для создания белка с новой складкой, названной Top7,^[9] и датчики для неестественных молекул.^[10] Разработка слитые белки дал рилонасепт, фармацевтический препарат, получивший Управление по контролю за продуктами и лекарствами (FDA) разрешение на лечение криопирин-ассоциированный периодический синдром.

Другой вычислительный метод, IPRO, успешно спроектировал переключение кофакторной специфичности ксилозоредуктазы Candida boidinii.^[11] Итеративная переработка и оптимизация белков (IPRO) модифицирует белки для увеличения или придания специфичности нативным или новым субстраты и кофакторы. Это делается путем многократного случайного возмущения структуры белков вокруг определенных проектных положений, определяя комбинацию с наименьшей энергией ротамеры и определение того, имеет ли новая конструкция более низкую энергию связи, чем предыдущие.^[12]

Проектирование с помощью вычислений также использовалось для разработки сложных свойств высокоупорядоченной сборки нанобелков.^[13] Белковая клетка, бактериоферритин E. coli (EcBfr), который естественным образом демонстрирует структурную нестабильность и поведение неполной самосборки за счет заселения двух состояний олигомеризации, является модельным белком в этом исследовании. Путем вычислительного анализа и сравнения с его гомологи, было обнаружено, что этот белок имеет меньше среднего димерный интерфейс на его двукратной оси симметрии, главным образом из-за существования межфазного водного кармана, сосредоточенного на двух связанных с водой остатках аспарагина. Чтобы исследовать возможность разработки EcBfr для модифицированной структурной стабильности, полуэмпирический вычислительный метод используется для виртуального исследования энергетических различий 480 возможных мутантов на димерной границе раздела по сравнению с дикого типа EcBfr. Это вычислительное исследование также сходится на аспарагины. Заменив эти два аспарагина на гидрофобный аминокислоты приводят к образованию белков, которые складываются в альфа-спиральный мономеры и собираются в клетки, что подтверждается круговым дихроизмом и просвечивающей электронной микроскопией. Как термическая, так и химическая денатурация подтверждают, что все переработанные белки, в соответствии с расчетами, обладают повышенной стабильностью. Одна из трех мутаций сдвигает популяцию в пользу состояния олигомеризации более высокого порядка в растворе, как показано с помощью эксклюзионной хроматографии и электрофореза в нативном геле.^[13]

А in silico метод, PoreDesigner,^[14] был успешно разработан для изменения конструкции белка бактериального канала (OmpF), чтобы уменьшить размер его пор с 1 нм до любого желаемого размера субнм. Эксперименты по транспортировке на самых узких порах показали полное отторжение солей при сборке в биомиметических блок-полимерных матрицах.

Смотрите также

Рекомендации

внешняя ссылка

• серверы для белковой инженерии и связанные темы на основе ЧТО ЕСЛИ ПО
• Ферменты, созданные с нуля - Исследователи конструируют невиданные ранее катализаторы, используя новую вычислительную технику, Обзор технологий, 10 марта 2008 г.