Мутагенез (метод молекулярной биологии) - Mutagenesis (molecular biology technique)

Эта статья о мутагенезе как о лабораторном методе. О мутагенезе как общем процессе см. мутагенез.
Типы мутаций, которые могут быть внесены случайным, сайт-направленным, комбинаторным или инсерционным мутагенезом.

В молекулярная биология, мутагенез это важный лабораторный метод, с помощью которого ДНК мутации намеренно спроектированный производить библиотеки мутантных генов, белков, штаммов бактерий или других генетически модифицированные организмы. Различные составляющие гена, а также его регуляторные элементы и его генные продукты могут быть мутированы, чтобы можно было детально изучить функционирование генетического локуса, процесса или продукта. Мутация может производить мутантные белки с интересными свойствами или усиленными или новыми функциями, которые могут иметь коммерческое использование. Также могут быть получены мутантные штаммы, которые имеют практическое применение или позволяют исследовать молекулярную основу конкретной функции клетки.

Сегодня существует множество методов мутагенеза. Первоначально мутации, искусственно вызванные в лаборатории, были полностью случайными с использованием таких механизмов, как УФ-облучение. Случайный мутагенез не может воздействовать на конкретные области или последовательности генома; однако с развитием сайт-направленный мутагенез, могут быть внесены более конкретные изменения. С 2013 года разработка CRISPR / Технология Cas9, основанная на системе защиты от прокариотических вирусов, позволила редактирование или мутагенез генома in vivo.[1] Сайт-направленный мутагенез оказался полезным в ситуациях, когда случайный мутагенез - нет. Другие методы мутагенеза включают комбинаторный и инсерционный мутагенез. Мутагенез, который не является случайным, можно использовать для клонирования ДНК,[2] исследовать действие мутагенов,[3] и инженерные белки.[4] Он также имеет медицинские приложения, такие как помощь пациентам с ослабленным иммунитетом, исследование и лечение заболеваний, включая ВИЧ и рак, а также лечение таких заболеваний, как бета-талассемия.[5]

Случайный мутагенез

Как Библиотеки ДНК создано случайный мутагенез пространство последовательности образцов. Показана аминокислота, замещенная в данном положении. Каждая точка или набор связанных точек является одним из членов библиотеки. ПЦР, подверженная ошибкам, случайным образом изменяет некоторые остатки на другие аминокислоты. Аланиновое сканирование заменяет каждый остаток белка на аланин, один за другим. Насыщение сайта заменяет каждую из 20 возможных аминокислот (или некоторые их подмножества) в одном положении, одну за другой.

Ранние подходы к мутагенезу основывались на методах, которые производили полностью случайные мутации. В таких методах клетки или организмы подвергаются воздействию мутагены затем отбираются мутанты с желаемыми характеристиками, такие как УФ-излучение или мутагенные химические вещества. Герман Мюллер обнаружил в 1927 году, что Рентгеновские лучи может вызвать генетические мутации в плодовые мошки,[6] и продолжил использовать созданных им мутантов для своих исследований в генетика.[7] За кишечная палочка, мутанты могут быть отобраны сначала воздействием УФ-излучения, а затем высеяны на агаризованную среду. Образованные колонии затем покрытый репликой, один в богатая среда, другой - в минимальной среде, и мутанты, у которых есть особые потребности в питании, затем могут быть идентифицированы по их неспособности расти в минимальной среде. Подобные процедуры могут быть повторены с другими типами ячеек и с другой средой для выбора.

Ряд методов генерации случайных мутаций в конкретных белки позже были разработаны экран для мутантов с интересными или улучшенными свойствами. Эти методы могут включать использование допированных нуклеотидов в олигонуклеотид синтез или проведение ПЦР реакция в условиях, которые усиливают неправильное включение нуклеотидов (склонная к ошибкам ПЦР), например, путем снижения точности репликации или использования аналогов нуклеотидов.[8] Вариант этого метода интеграции непредвзятых мутаций в гене: мутагенез с насыщением последовательности.[9] Продукты ПЦР, содержащие мутации, затем клонированный в вектор выражения и затем полученные мутантные белки могут быть охарактеризованы.

В исследованиях на животных алкилирующие агенты Такие как N-этил-N-нитрозомочевина (ENU) были использованы для создания мутантных мышей.[10][11] Этилметансульфонат (EMS) также часто используется для создания мутантов животных, растений и вирусов.[12][13][14]

В Евросоюз закон (как директива 2001/18), этот вид мутагенеза может быть использован для получения ГМО но продукты освобождены от регулирования: без маркировки, без оценки.[15]

Сайт-направленный мутагенез

Основная статья: Сайт-направленный мутагенез

До разработки методов сайт-направленного мутагенеза все сделанные мутации были случайными, и ученым приходилось использовать отбор по желаемому фенотипу, чтобы найти желаемую мутацию. Методики случайного мутагенеза имеют преимущество с точки зрения того, сколько мутаций может быть произведено; однако, хотя случайный мутагенез может приводить к изменению отдельных нуклеотидов, он не обеспечивает особого контроля над тем, какой нуклеотид изменяется.[5] Поэтому многие исследователи стремятся внести отдельные изменения в ДНК точным, зависящим от сайта образом. Ранние попытки использования аналогов нуклеотидов и других химических веществ были впервые использованы для создания локализованных точечные мутации.[16] К таким химическим веществам относятся аминопурин, который индуцирует AT в GC переход,[17] в то время как нитрозогуанидин,[18] бисульфит,[19] и н4-гидроксицитидин может вызывать переход GC в AT.[20][21] Эти методы позволяют сконструировать специфические мутации в белке; однако они не являются гибкими в отношении типов генерируемых мутантов, а также не столь специфичны, как более поздние методы сайт-направленного мутагенеза, и поэтому обладают некоторой степенью случайности. Другие технологии, такие как расщепление ДНК на определенных участках хромосомы, добавление новых нуклеотидов и обмен парами оснований, теперь позволяют решать, куда могут идти мутации.[11][8]

Упрощенная схема сайт-направленного мутагенного метода с использованием предварительно изготовленных олигонуклеотидов в реакции удлинения праймера с помощью ДНК-полимеразы

Современные методы сайт-специфической мутации происходят от техники удлинения праймера, разработанной в 1978 году. Такие методы обычно включают использование предварительно изготовленных мутагенных олигонуклеотидов в грунтовка реакция расширения с ДНК-полимераза. Этот метод позволяет точечную мутацию или удаление или же вставка небольших участков ДНК на определенных участках. Достижения в методологии сделали такой мутагенез теперь относительно простым и эффективным процессом.[3]

Постоянно разрабатываются новые и более эффективные методы сайт-направленного мутагенеза. Например, метод, называемый «экстрактом клонирования с бесшовным лигированием» (или сокращенно SLiCE), позволяет клонировать определенные последовательности ДНК в геноме, и в геном можно вставить более одного фрагмента ДНК одновременно.[2]

Сайт-направленный мутагенез позволяет исследовать эффект конкретной мутации. Есть множество применений; например, его использовали для определения степени восприимчивости определенных видов к химическим веществам, которые часто используются в лабораториях. В эксперименте использовался сайт-направленный мутагенез для имитации ожидаемых мутаций конкретного химического вещества. Мутация привела к изменению определенных аминокислот, и влияние этой мутации было проанализировано.[3]

Мутагенез с насыщением сайта - это тип сайт-направленного мутагенеза. На этом изображении показан мутагенез насыщения одного положения в теоретическом протеине с 10 остатками. Версия белка дикого типа показана вверху, где М представляет собой первую аминокислоту метионин, а * представляет собой окончание трансляции. Все 19 мутантов изолейцина в положении 5 показаны ниже.

Сайт-ориентированный подход может применяться систематически такими методами, как аланиновое сканирование мутагенез, при котором остатки систематически мутируют в аланин чтобы идентифицировать остатки, важные для структуры или функции белка.[22] Еще один комплексный подход - сайт насыщающий мутагенез где один кодон или набор кодонов может быть заменен всеми возможными аминокислоты на определенных должностях.[23][24]

Комбинаторный мутагенез

Комбинаторный мутагенез - это метод сайт-направленной инженерии белка, с помощью которого можно одновременно создавать несколько мутантов белка на основе анализа эффектов дополнительных индивидуальных мутаций.[25] Это полезный метод для оценки комбинаторного эффекта большого количества мутаций на функцию белка.[26] Большое количество мутантов может быть проверено на конкретную характеристику с помощью комбинаторного анализа.[25] В этом методе множественные положения или короткие последовательности вдоль цепи ДНК могут быть полностью изменены для получения всеобъемлющей библиотеки мутантных белков.[25] Частоту встречаемости полезных вариантов можно повысить с помощью различных способов построения библиотек мутагенеза. Один из подходов к этой методике заключается в извлечении и замене части последовательности ДНК библиотекой последовательностей, содержащей все возможные комбинации в желаемом сайте мутации. Содержимое вставленного сегмента может включать последовательности, имеющие структурное значение, иммуногенное свойство или ферментативную функцию. Сегмент также может быть вставлен в ген случайным образом, чтобы оценить структурное или функциональное значение конкретной части белка.[25]

Вставной мутагенез

Дальнейшая информация: Сигнатурный меченый мутагенез и Транспозонный мутагенез

Встраивание одной или нескольких пар оснований, приводящее к мутациям ДНК, также известно как инсерционный мутагенез.[27] Такие искусственно созданные мутации могут предоставить важную информацию в исследованиях рака, например, механистическое понимание развития болезни. Ретровирусы и транспозоны - главные инструменты инсерционного мутагенеза. Ретровирусы, такие как вирус опухоли молочной железы мыши и вирус лейкемии мышей, можно использовать для идентификации генов, участвующих в канцерогенезе, и понимания биологических путей конкретных видов рака.[28] Транспозоны, хромосомные сегменты, которые могут подвергаться транспозиции, могут быть разработаны и применены для инсерционного мутагенеза в качестве инструмента для открытия генов рака.[28] Эти хромосомные сегменты позволяют применять инсерционный мутагенез практически к любой ткани по выбору, а также обеспечивают более полное и беспристрастное секвенирование ДНК.[28]

Исследователи обнаружили четыре механизма инсерционного мутагенеза, которые можно использовать на людях. первый механизм называется вставкой энхансера. Энхансеры усиливают транскрипцию определенного гена, взаимодействуя с промотором этого гена. Этот конкретный механизм был впервые использован для помощи пациентам с тяжелым иммунодефицитом, в которых мне нужен костный мозг. Затем пациентам вводили гаммаретровирусы, несущие усилители. Второй механизм называется вставкой промотора. Промоторы предоставляют нашим клеткам определенные последовательности, необходимые для начала трансляции. Введение промотора помогло исследователям узнать больше о вирусе ВИЧ. Третий механизм - инактивация гена. Примером инактивации гена является использование инсерционного мутагенеза для вставки ретровируса, который разрушает геном Т-лимфоцитов у больных лейкемией, и предоставления им специфического антигена, называемого CAR, позволяющего Т-клеткам нацеливаться на раковые клетки. Последний механизм называется заменой 3 'конца мРНК. Наши гены иногда подвергаются точечным мутациям, вызывая бета-талассемию, которая нарушает функцию красных кровяных телец. Чтобы решить эту проблему, вводится правильная последовательность генов эритроцитов и производится замена.[5]

Гомологичная рекомбинация

Гомологичная рекомбинация может использоваться для создания специфической мутации в организме. Вектор, содержащий последовательность ДНК, подобную изменяемому гену, вводится в клетку и в процессе рекомбинации заменяет целевой ген в хромосоме. Этот метод может использоваться для введения мутации или нокаута гена, например, как используется при производстве нокаутные мыши.[29]

CRISPR

Основная статья: Редактирование генов CRISPR

С 2013 года разработка CRISPR -Cas9 технология позволила эффективно вводить различные типы мутаций в геном самых разных организмов. Этот метод не требует места для введения транспозона, не оставляет маркера, а его эффективность и простота сделали его предпочтительным методом для редактирование генома.[30][31]

Синтез генов

Поскольку стоимость синтеза олигонуклеотидов ДНК падает, искусственный синтез полного гена в настоящее время является жизнеспособным методом введения мутаций в ген. Этот метод позволяет проводить обширные мутации в нескольких сайтах, включая полную переработку использования кодонов в гене, чтобы оптимизировать его для конкретного организма.[32]

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ Сюй П.Д., Ландер Э.С., Чжан Ф. (июнь 2014 г.). «Разработка и применение CRISPR-Cas9 для геномной инженерии». Клетка. 157 (6): 1262–78. Дои:10.1016 / j.cell.2014.05.010. ЧВК  4343198. PMID  24906146.
  2. ^ а б Мотохаши К. (июнь 2015 г.). «Простой и эффективный метод бесшовного клонирования ДНК с использованием SLiCE из лабораторных штаммов Escherichia coli и его применение для сайт-направленного мутагенеза SLiP». BMC Biotechnology. 15: 47. Дои:10.1186 / s12896-015-0162-8. ЧВК  4453199. PMID  26037246.
  3. ^ а б c Деринг Дж. А., Ли С., Кристиансен К., Эвенсет Л., Бэррон М. Г., Силте I, Лалоне, Калифорния (ноябрь 2018 г.). «Сайт-направленный мутагенез In Silico дает информацию о видоспецифических прогнозах химической восприимчивости, полученных на основе выравнивания последовательностей, для прогнозирования межвидовой восприимчивости (SeqAPASS)». Токсикологические науки. 166 (1): 131–145. Дои:10.1093 / toxsci / kfy186. ЧВК  6390969. PMID  30060110.
  4. ^ Чой Г.К., Чжоу П., Юэнь С.Т., Чан Б.К., Сюй Ф., Бао С. и др. (Август 2019 г.). «Комбинаторный мутагенез в массе оптимизирует деятельность по редактированию генома SpCas9». Природные методы. 16 (8): 722–730. Дои:10.1038 / s41592-019-0473-0. PMID  31308554.
  5. ^ а б c Bushman FD (февраль 2020 г.). «Ретровирусный инсерционный мутагенез у людей: данные о четырех генетических механизмах, способствующих размножению клеточных клонов». Молекулярная терапия. 28 (2): 352–356. Дои:10.1016 / j.ymthe.2019.12.009. ЧВК  7001082. PMID  31951833.
  6. ^ Мюллер HJ (июль 1927 г.). «Искусственная трансмутация гена» (PDF). Наука. 66 (1699): 84–7. Bibcode:1927Научный .... 66 ... 84М. Дои:10.1126 / science.66.1699.84. PMID  17802387.
  7. ^ Ворона Дж. Ф., Абрахамсон С. (декабрь 1997 г.). «Семьдесят лет назад: мутация становится экспериментальной». Генетика. 147 (4): 1491–6. ЧВК  1208325. PMID  9409815.
  8. ^ а б Блэкберн GM, изд. (2006). Нуклеиновые кислоты в химии и биологии (3-е изд.). Королевское химическое общество. С. 191–192. ISBN  978-0854046546.
  9. ^ Вонг Т.С., Ти К.Л., Хауэр Б., Шванеберг Ю. (февраль 2004 г.). «Мутагенез с насыщением последовательностей (SeSaM): новый метод направленной эволюции». Исследования нуклеиновых кислот. 32 (3): 26e – 26. Дои:10.1093 / nar / gnh028. ЧВК  373423. PMID  14872057.
  10. ^ Джастис М.Дж., Новероске Дж. К., Вебер Дж. С., Чжэн Б., Брэдли А. (1999). «Мутагенез ENU мышей» (PDF). Молекулярная генетика человека. 8 (10): 1955–63. Дои:10.1093 / hmg / 8.10.1955. PMID  10469849.
  11. ^ а б Hrabé de Angelis M, Balling R (май 1998 г.). «Крупномасштабные экраны ENU в мышах: генетика встречается с геномикой». Мутационные исследования. 400 (1–2): 25–32. Дои:10.1016 / с0027-5107 (98) 00061-х. PMID  9685575.
  12. ^ Флиботт С., Эджли М.Л., Чаудри И., Тейлор Дж., Нил С.Е., Рогула А. и др. (Июнь 2010 г.). «Полногеномное профилирование мутагенеза у Caenorhabditis elegans». Генетика. 185 (2): 431–41. Дои:10.1534 / genetics.110.116616. ЧВК  2881127. PMID  20439774.
  13. ^ Бёкель C (2008). Скрининг EMS: от мутагенеза до скрининга и картирования. Методы молекулярной биологии. 420. С. 119–38. Дои:10.1007/978-1-59745-583-1_7. PMID  18641944.
  14. ^ Favor AH, Llanos CD, Youngblut MD, Bardales JA (2020). «Оптимизация инженерии бактериофагов с помощью платформы ускоренной эволюции». Научные отчеты. 10: 1–10. Дои:10.1038 / s41598-020-70841-1. ЧВК  7438504. PMID  32814789.
  15. ^ Кринке С. (март 2018 г.). «Директива по ГМО: истоки исключения мутагенеза». Inf'OGM.
  16. ^ Шортл Д., ДиМайо Д., Натанс Д. (1981). «Направленный мутагенез». Ежегодный обзор генетики. 15: 265–94. Дои:10.1146 / annurev.ge.15.120181.001405. PMID  6279018.
  17. ^ Карас И.В., Макиннес М.А., Персинг Д.Х., Коффино П., Мартин Д.В. (сентябрь 1982 г.). «Механизм мутагенеза 2-аминопурина в клетках Т-лимфосаркомы мыши». Молекулярная и клеточная биология. 2 (9): 1096–103. Дои:10.1128 / mcb.2.9.1096. ЧВК  369902. PMID  6983647.
  18. ^ МакХью Г.Л., Миллер К.Г. (октябрь 1974 г.). «Выделение и характеристика мутантов пролинпептидазы Salmonella typhimurium». Журнал бактериологии. 120 (1): 364–71. Дои:10.1128 / JB.120.1.364-371.1974. ЧВК  245771. PMID  4607625.
  19. ^ Шортл Д., Натанс Д. (май 1978 г.). «Местный мутагенез: метод создания вирусных мутантов с заменами оснований в заранее выбранных областях вирусного генома». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 75 (5): 2170–4. Bibcode:1978PNAS ... 75.2170S. Дои:10.1073 / pnas.75.5.2170. ЧВК  392513. PMID  209457.
  20. ^ Флавелл Р.А., Сабо Д.Л., Бандл Е.Ф., Вайсманн С. (январь 1975 г.). «Сайт-направленный мутагенез: влияние экстрацистронной мутации на распространение РНК бактериофага Qbeta in vitro». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 72 (1): 367–71. Bibcode:1975ПНАС ... 72..367Ф. Дои:10.1073 / pnas.72.1.367. ЧВК  432306. PMID  47176.
  21. ^ Мюллер В., Вебер Н., Мейер Ф., Вайсманн С. (сентябрь 1978 г.). «Сайт-направленный мутагенез в ДНК: создание точечных мутаций в клонированной бета-глобиновой комплементарной ДНК в положениях, соответствующих аминокислотам со 121 по 123». Журнал молекулярной биологии. 124 (2): 343–58. Дои:10.1016/0022-2836(78)90303-0. PMID  712841.
  22. ^ Ванесса Э. Грей; Рональд Дж. Хауз; Дуглас М. Фаулер (1 сентября 2017 г.). «Анализ данных крупномасштабного мутагенеза для оценки влияния отдельных аминокислотных замен». Генетика. 207 (1): 53–61. Дои:10.1534 / генетика.117.300064. ЧВК  5586385. PMID  28751422.
  23. ^ Reetz, M. T .; Карбаллейра Дж. Д. (2007). «Итерационный мутагенез насыщения (ISM) для быстрой направленной эволюции функциональных ферментов». Протоколы природы. 2 (4): 891–903. Дои:10.1038 / nprot.2007.72. PMID  17446890.
  24. ^ Черчионе, Дерек; Лавлак, Кэтрин; Тиллотсон, Эрик Л .; Харбински, Фред; DaSilva, Jen; Келли, Чейз П .; Кестон-Смит, Элиза; Fernandez, Cecilia A .; Myer, Vic E .; Джаярам, ​​Харихаран; Steinberg, Barrett E .; Сюй, Шуан-юн (16 апреля 2020 г.). «Библиотеки SMOOT и индуцированная фагом направленная эволюция Cas9 для создания сниженной нецелевой активности». PLOS ONE. 15 (4): e0231716. Дои:10.1371 / journal.pone.0231716. ЧВК  7161989. PMID  32298334.
  25. ^ а б c d Паркер А.С., Грисволд К.Э., Бейли-Келлог С. (ноябрь 2011 г.). «Оптимизация комбинаторного мутагенеза». Журнал вычислительной биологии. 18 (11): 1743–56. Bibcode:2011LNCS.6577..321P. Дои:10.1089 / cmb.2011.0152. ЧВК  5220575. PMID  21923411.
  26. ^ Choi GC, Zhou P, Yuen CT, Chan BK, Xu F, Bao S, Chu HY, Thean D, Tan K, Wong KH, Zheng Z, Wong AS (август 2019). «Комбинаторный мутагенез в массе оптимизирует деятельность по редактированию генома SpCas9». Природные методы. 16 (8): 722–730. Дои:10.1038 / s41592-019-0473-0. PMID  31308554.
  27. ^ Uren AG, Kool J, Berns A, van Lohuizen M (ноябрь 2005 г.). «Ретровирусный инсерционный мутагенез: прошлое, настоящее и будущее». Онкоген. 24 (52): 7656–72. Дои:10.1038 / sj.onc.1209043. PMID  16299527.
  28. ^ а б c Василиу Г., Рад Р., Брэдли А. (01.01.2010). Wassarman PM, Soriano PM (ред.). «Использование транспозонов ДНК для открытия гена рака у мышей». Методы в энзимологии. Руководство по методам развития мышей, Часть B: Молекулярная генетика мышей (2-е изд.). Академическая пресса. 477: 91–106. Дои:10.1016 / с0076-6879 (10) 77006-3. ISBN  9780123848802. PMID  20699138.
  29. ^ «Метод гомологичной рекомбинации (и нокаут-мышь)». Дэвидсон колледж.
  30. ^ Дэмиен Био-Пеллетье; Винсент Дж. Дж. Мартин (2016). «Бесшовный сайт-направленный мутагенез генома Saccharomyces cerevisiae с использованием CRISPR-Cas9». Журнал биологической инженерии. 10: 6. Дои:10.1186 / s13036-016-0028-1. ЧВК  4850645. PMID  27134651.
  31. ^ Сюй С (20 августа 2015 г.). «Применение редактирования генома CRISPR-Cas9 у Caenorhabditis elegans». J Genet Genomics. 42 (8): 413–21. Дои:10.1016 / j.jgg.2015.06.005. ЧВК  4560834. PMID  26336798.
  32. ^ Худяков Ю.Е., Филдс Н.А., ред. (25 сентября 2002 г.). Искусственная ДНК: методы и применение. CRC Press. п. 13. ISBN  9781420040166.

внешняя ссылка

Библиотечные ресурсы о
Мутагенез