Генетический экран - Genetic screen

Эта статья посвящена способу определения функций гены. Для скрининга или тестирования на генетические заболевания см. генетическое тестирование.

А генетический скрининг или же скрининг мутагенеза это экспериментальный метод, используемый для выявления и отбора людей, обладающих фенотип представляет интерес в мутагенизированной популяции.[1] Следовательно, генетический скрининг - это тип фенотипический скрининг. Генетические скрининги могут предоставить важную информацию о ген функции, а также молекулярные события, которые лежат в основе биологического процесса или пути. Пока геномные проекты определили обширный перечень генов у многих различных организмов, генетический скрининг может дать ценную информацию о том, как эти гены функционируют.[2][3][4][5][6]

Базовый скрининг

Прогрессивная генетика (или прямой генетический скрининг) - это подход, используемый для идентификации генов (или набора генов), ответственных за определенный фенотип организма. Обратная генетика (или обратный генетический скрининг), с другой стороны, анализирует фенотип организма после нарушения работы известного гена. Короче говоря, прямая генетика начинается с фенотипа и движется к идентификации ответственного (ых) гена (ов), тогда как обратная генетика начинается с известного гена и анализирует эффект его разрушения путем анализа полученных фенотипов. Как прямой, так и обратный генетический скрининг направлены на определение функции генов.[1]

Успешный прямой генетический скрининг часто состоит из двух ключевых компонентов. Первый - это определенный генетический фон используемого организма, а второй - простая, но постоянная экспериментальная процедура для идентификации интересующих мутантов. Определенный генетический фон позволяет исследователям с большей эффективностью идентифицировать и локализовать затронутые гены у мутантов. Упрощенный метод скрининга полезен, поскольку он позволяет проводить скрининг большего числа людей, тем самым увеличивая вероятность получения и идентификации представляющих интерес мутантов.[3]

Поскольку естественный аллельный мутации редки, генетики перед скринингом часто мутагенезируют популяцию людей, подвергая их воздействию известного мутаген, например, химическое вещество или излучение, тем самым генерируя гораздо более высокую частоту хромосомные мутации.[1] У некоторых организмов мутагены могут быть полезны для выполнения экраны насыщения. Экраны насыщения используются для выявления всех генов, участвующих в определенном фенотипе организма или вида. Скрининг проводится путем картирования мутантов биологического процесса до тех пор, пока не будут обнаружены новые гены / генные мутации. Кристиан Нюсслейн-Фольхард и Эрик Вишаус были первыми, кто выполнил подобную процедуру скрининга.[7]

Варианты скрининга

Было разработано множество вариантов скрининга для выяснения гена, который приводит к интересующему мутантному фенотипу.

Усилитель

An улучшающий экран начинается с мутанта, у которого есть затронутый интересующий процесс с известной мутацией гена. Затем скрининг можно использовать для идентификации дополнительных генов или генных мутаций, которые играют роль в этом биологическом или физиологическом процессе. Скрининг генетического энхансера выявляет мутации, которые усиливают интересующий фенотип у уже мутантного человека. Фенотип двойного мутанта (индивидуума с энхансером и исходной фоновой мутацией) более выражен, чем у любого из фенотипов одиночного мутанта. Улучшение должно превосходить ожидаемые фенотипы двух мутаций само по себе, и поэтому каждая мутация может считаться усилителем другой. Выделение мутантов-энхансеров может привести к идентификации взаимодействующих генов или генов, которые действуют избыточно по отношению друг к другу.[8]

Подавитель

А глушитель экран используется для идентификации супрессорные мутации которые смягчают или изменяют фенотип исходной мутации в процессе, определяемом как синтетическая жизнеспособность.[9] Супрессорные мутации можно описать как вторые мутации на участке хромосомы, отличном от исследуемой мутации, которые подавляют фенотип исходной мутации.[10] Если мутация находится в том же гене, что и исходная мутация, она называется внутригенное подавление, тогда как мутация, локализованная в другом гене, известна как экстрагенное подавление или межгенное подавление.[1] Супрессорные мутации чрезвычайно полезны для определения функций биохимических путей внутри клетки и взаимоотношений между различными биохимическими путями.

Чувствительный к температуре

А термочувствительный экран включает выполнение температурных сдвигов для усиления мутантного фенотипа. Популяция, выращенная при низкой температуре, будет иметь нормальный фенотип; однако мутация в конкретном гене сделает его нестабильным при более высокой температуре. Например, при проверке температурной чувствительности у плодовых мушек может потребоваться повышение температуры. температура в клетке, пока некоторые из них не упадут в обморок, а затем открывают портал, чтобы позволить другим сбежать. Лица, выбранные на экране, могут нести необычную версию ген вовлечены в интересующий фенотип. Преимущество аллелей, обнаруженных в этом типе скрининга, состоит в том, что мутантный фенотип условный и может быть активирован простым повышением температуры. А нулевая мутация в таком гене может быть смертельным для эмбриона, и такие мутанты будут пропущены при базовом скрининге. Знаменитый термочувствительный экран был произведен самостоятельно Ли Хартвелл и Пол Медсестра для выявления мутантов, дефектных по клеточному циклу в С. cerevisiae и С. Помбе, соответственно.

Отображение мутантов

Посредством классическая генетика подход, исследователь затем обнаружит (нанесет на карту) ген на его хромосома к скрещивание с людьми, которые несут другие необычные черты и сбор статистики о том, как часто эти два признака наследуются вместе. Классические генетики использовали бы фенотипические признаки для картирования нового мутанта. аллели. С появлением геномных последовательностей для модельных систем, таких как Drosophila melanogaster, Arabidopsis thaliana и C. elegans много однонуклеотидный полиморфизм (SNP) теперь определены, которые можно использовать в качестве признаков для картирования. Фактически, Экран Гейдельберга, который был разработан в 1980 г. Nüsslein-Volhard и Wieschaus расчистил дорогу будущим ученым в этой области.[11] SNP являются предпочтительными признаками для картирования, поскольку они очень часто встречаются, порядка одной разницы на 1000 пар оснований, между различными разновидностями организмов. Мутагены, такие как случайные вставки ДНК трансформация или активный транспозоны также может быть использован для создания новых мутантов. Эти методы имеют преимущество в том, что они маркируют новые аллели известным молекулярным (ДНК) маркер что может облегчить быструю идентификацию гена.[7]

Позиционное клонирование

Позиционное клонирование - это метод идентификации гена, при котором ген определенного фенотипа идентифицируется только по его приблизительному хромосомному положению (но не по функции); это известно как регион-кандидат. Первоначально область-кандидат может быть определена с использованием таких методов, как анализ связей, а затем используется позиционное клонирование для сужения области-кандидата до тех пор, пока не будут обнаружены ген и его мутации. Позиционное клонирование обычно включает в себя выделение частично перекрывающихся сегментов ДНК из геномных библиотек для продвижения по хромосоме к определенному гену. В ходе позиционного клонирования необходимо определить, является ли рассматриваемый в настоящее время сегмент ДНК частью гена.

Тесты, используемые для этой цели, включают межвидовую гибридизацию, идентификацию неметилированных Острова CpG, захват экзонов, прямой кДНК отбор, компьютерный анализ последовательности ДНК, скрининг мутаций у пораженных лиц и тесты на экспрессию генов. Для геномов, в которых области генетические полиморфизмы Как известно, позиционное клонирование включает идентификацию полиморфизмов, фланкирующих мутацию. Этот процесс требует, чтобы фрагменты ДНК из ближайшего известного генетического маркера постепенно клонировались и секвенировались, приближаясь к мутантному аллелю с каждым новым клоном. Этот процесс производит карта контига из локус и известен как хромосомная ходьба. С завершением проектов секвенирования генома, таких как Проект "Геном человека" современное позиционное клонирование может напрямую использовать готовые контиги из баз данных геномных последовательностей.

Для каждого нового Клон ДНК полиморфизм идентифицируется и тестируется в популяции картографирования для его рекомбинация частота по сравнению с мутантным фенотипом. Когда клон ДНК находится на мутантном аллеле или близко к нему, частота рекомбинации должна быть близкой к нулю. Если хромосомная прогулка происходит через мутантный аллель, новые полиморфизмы начнут показывать увеличение частоты рекомбинации по сравнению с мутантным фенотипом. В зависимости от размера популяции картирования мутантный аллель может быть сужен до небольшой области (<30 Kb). Сравнение последовательностей между дикого типа и мутант Затем ДНК в этой области требуется для обнаружения ДНК. мутация что вызывает фенотипические различия.

Современное позиционное клонирование может более непосредственно извлекать информацию из проектов геномного секвенирования и существующих данных путем анализа генов в области-кандидате. Затем можно определить приоритетность генов потенциальных заболеваний из области-кандидата, что потенциально снизит объем работы. Гены с паттернами экспрессии, соответствующими фенотипу заболевания, показывающими (предполагаемую) функцию, связанную с фенотипом, или гомологичными другому гену, связанному с этим фенотипом, являются приоритетными кандидатами. Подобное обобщение методов позиционного клонирования также известно как открытие позиционного гена.

Позиционное клонирование - это эффективный метод беспристрастного выделения генов болезней, который используется для идентификации генов болезней, вызывающих Мышечная дистрофия Дюшенна, болезнь Хантингтона, и кистозный фиброз. Однако сложности при анализе возникают, если болезнь обнаруживает гетерогенность локуса.

Рекомендации

  1. ^ а б c d Хартвелл Л. Х., Худ Л., Голдберг М. Л., Рейнольдс А. Э., Сильвер Л. М., Верес Р. К. (2008). Генетика: от генов к геномам. Бостон: Высшее образование Макгроу-Хилла. ISBN  978-0-07-284846-5.
  2. ^ Паттон Е.Е., Зон Л.И. (декабрь 2001 г.). «Искусство и дизайн генетических экранов: рыбки данио». Nat. Преподобный Жене. 2 (12): 956–66. Дои:10.1038/35103567. PMID  11733748.
  3. ^ а б Page DR, Grossniklaus U (февраль 2002 г.). «Искусство и дизайн генетических экранов: Arabidopsis thaliana". Nat. Преподобный Жене. 3 (2): 124–36. Дои:10.1038 / nrg730. PMID  11836506.
  4. ^ Сент-Джонстон Д. (март 2002 г.). «Искусство и дизайн генетических экранов: Drosophila melanogaster". Nat. Преподобный Жене. 3 (3): 176–88. Дои:10.1038 / nrg751. PMID  11972155.
  5. ^ Йоргенсен Э.М., Mango SE (май 2002 г.). «Искусство и дизайн генетических экранов: Caenorhabditis elegans". Nat. Преподобный Жене. 3 (5): 356–69. Дои:10.1038 / nrg794. PMID  11988761.
  6. ^ Casselton L, Zolan M (сентябрь 2002 г.). «Искусство и дизайн генетических экранов: нитчатые грибы». Nat. Преподобный Жене. 3 (9): 683–97. Дои:10.1038 / nrg889. PMID  12209143.
  7. ^ а б «Генетический экран». Исследование стволовых клеток. Архивировано из оригинал на 2012-04-01. Получено 2012-05-03.
  8. ^ Герман Р.К., Йохем Дж. (2005). «Генетические усилители». WormBook: 1–11. Дои:10.1895 / wormbook.1.27.1. ЧВК  4780930. PMID  18023119.
  9. ^ Puddu, F .; Oelschlaegel, T; Герини, я; Гейслер, штат Нью-Джерси; Ниу, Н; Herzog, M; Сальгеро, I; Очоа-Монтаньо, B; Viré, E; Sung, P; Адамс, диджей; Кин, TM; Джексон, СП (2015). «Геномный скрининг синтетической жизнеспособности определяет функцию Sae2 в репарации ДНК». EMBO Журнал. 34 (11): 1509–1522. Дои:10.15252 / embj.201590973. ЧВК  4474527. PMID  25899817.
  10. ^ Ходжкин Дж (2005). «Генетическое подавление». WormBook: 1–13. Дои:10.1895 / wormbook.1.59.1. ЧВК  4781008. PMID  18023120.
  11. ^ Сент-Джонстон, Д. (2002). «Искусство и дизайн генетических экранов: Drosophila melanogaster». Обзоры природы. Генетика. 3 (3): 176–88. Дои:10.1038 / nrg751. PMID  11972155.

внешняя ссылка