Транспозонный мутагенез - Transposon mutagenesis

Транспозонный мутагенез, или же транспозиционный мутагенез, это биологический процесс, который позволяет генам переноситься в организм хозяина хромосома, прерывание или изменение функции сохранившийся ген на хромосоме и вызывая мутация.[1] Мутагенез транспозонов намного эффективнее, чем химический мутагенез, с более высокой частотой мутаций и меньшими шансами убить организм. Другие преимущества включают способность вызывать мутации с единичным попаданием, способность включать выбираемые маркеры в конструировании штаммов и способности восстанавливать гены после мутагенеза.[2] К недостаткам можно отнести низкую частоту транспонирования в живых системах и неточность большинства систем транспонирования.

История

Мутагенез транспозонов был впервые изучен Барбара МакКлинток в середине 20 века во время работы с кукурузой, получившей Нобелевскую премию. МакКлинток получила степень бакалавра в 1923 году в Корнельском сельскохозяйственном колледже. К 1927 году она защитила докторскую диссертацию по ботанике и сразу же начала работать над темой кукуруза хромосомы.[3] В начале 1940-х Макклинток изучал потомство самоопыляемых растений кукурузы, полученных в результате кресты сломанная хромосома 9. У этих растений отсутствовали теломеры. Это исследование привело к первому открытию сменный элемент,[4] Отсюда мутагенез транспозонов был использован как биологический инструмент.

Динамика

В случае бактерии, транспозиционный мутагенез обычно осуществляется посредством плазмида откуда транспозон извлекается и вставляется в хромосому хозяина. Обычно для этого требуется набор ферменты включая транспозаза быть переведено. Транспозаза может быть экспрессирована либо на отдельной плазмиде, либо на плазмиде, содержащей ген, который необходимо интегрировать. Как вариант, инъекция транспозазы мРНК в клетку-хозяина может вызывать трансляцию и выражение.[5] Ранние эксперименты по мутагенезу транспозонов основывались на бактериофаги и конъюгативные бактериальные плазмиды для вставки последовательностей. Они были очень неспецифичными и затрудняли включение определенных генов. Более новый метод, называемый челночным мутагенезом, использует определенные клонированные гены от вида-хозяина для включения генетических элементов.[2] Другой эффективный подход - доставка транспозонов через вирусные капсиды. Это облегчает интеграцию в хромосому и долгосрочное трансген выражение.[5]

Транспозонная система TN5

Структура транспозона Tn5 с последовательностью вставки, фланкирующей кассету генов, в данном случае генов устойчивости к лекарствам.

Система транспозонов Tn5 представляет собой модельную систему для изучения транспозиции и применения мутагенеза транспозонов. Tn5 представляет собой бактериальный композитный транспозон, в котором гены (исходная система, содержащая устойчивость к антибиотикам гены) между двумя почти идентичными инсерционные последовательности, названные IS50R и IS50L, соответствующие правой и левой сторонам транспозона соответственно.[6] Последовательность IS50R кодирует два белка, Tnp и Inh. Эти два белка идентичны по последовательности, за исключением того факта, что Inh не содержит 55 N-концевой аминокислоты. Tnp кодирует транспозазу для всей системы, а Inh кодирует ингибитор транспозазы. Связывание ДНК домен Tnp находится в 55 N-концевых аминокислотах, и поэтому эти остатки необходимы для функционирования.[6] Последовательности IS50R и IS50L обе фланкированы 19-базовая пара элементы на внутреннем и внешнем концах транспозона, обозначенные IE и OE соответственно. Мутация этих областей приводит к неспособности генов транспозаз связываться с последовательностями. Связывающие взаимодействия между транспозазой и этими последовательностями очень сложны и зависят от Метилирование ДНК и другие эпигенетический Метки.[6] Кроме того, другие белки, по-видимому, способны связываться и влиять на транспозицию элементов IS50, таких как DnaA.

Наиболее вероятный путь транспозиции Tn 5 является общим для всех систем транспозонов. Он начинается с того, что Tnp связывает последовательности OE и IE каждой последовательности IS50. Два конца сводятся вместе, и через олигомеризация ДНК последовательность вырезается из хромосомы. После введения 9-базовой пары 5 'концов в ДНК-мишени транспозон и включенные в него гены вставляются в ДНК-мишень, дублируя области на любом конце транспозона.[6] Интересующие гены могут быть генно-инженерный в систему транспозонов между последовательностями IS50. Поставив транспозон под контроль хозяина промоутер, гены будут выражены. Включенные гены обычно включают, помимо интересующего гена, выбираемый маркер для идентификации трансформантов, a эукариотический промоутер/терминатор (если экспрессируется эукариотом) и 3 ' UTR последовательности для разделения генов в полицистронный отрезок последовательности.

Система транспозонов "Спящая красавица"

В Система транспозонов "Спящая красавица" (SBTS) - первая успешная невирусная вектор для включения генная кассета в позвоночное животное геном. Вплоть до разработки этой системы основными проблемами невирусной генной терапии было внутриклеточное разрушение трансгена из-за того, что он считался Прокариоты и неэффективная доставка трансгена в системы органов. SBTS произвела революцию в этих вопросах, объединив преимущества вирусов и «голой» ДНК. Он состоит из транспозона, содержащего кассету экспрессируемых генов, а также собственного фермента транспозазы. Путем транспонирования кассеты непосредственно в геном организма из плазмиды можно добиться устойчивой экспрессии трансгена.[2] Это может быть дополнительно уточнено путем улучшения последовательностей транспозонов и используемых ферментов транспозаз. SB100X - это гиперактивная транспозаза млекопитающих, которая примерно в 100 раз эффективнее типичной транспозазы первого поколения. Включение этого фермента в кассету приводит к еще более устойчивой экспрессии трансгена (более одного года). Кроме того, частота трансгенеза может достигать 45% при использовании пронуклеарная инъекция в мышь зиготы.[7]

Система транспозонов "Спящей красавицы". Фермент транспозазы может быть выражен в СНГ или в транс в генную кассету.

Механизм SBTS аналогичен системе транспозона Tn5, однако последовательности ферментов и генов имеют эукариотическую природу, в отличие от прокариотических. Транпозаза системы может действовать в транс а также в СНГ, позволяя разнообразный набор структур транспозонов. Сам транспозон окружен инвертированные повторяющиеся последовательности, каждая из которых повторяется дважды напрямую, называемые последовательностями IR / DR. Внутренняя область состоит из гена или последовательности, подлежащей транспонированию, а также может содержать ген транспозазы. Альтернативно, транспозаза может быть закодирована на отдельной плазмиде или введена в форме белка. Еще один подход состоит во включении генов транспозона и транспозазы в вирусный вектор, который может нацеливаться на выбранную клетку или ткань. Белок транспозазы чрезвычайно специфичен в последовательностях, которые он связывает, и способен отличать свои последовательности IR / DR от аналогичной последовательности по трем парам оснований. Как только фермент связывается с обоими концами транспозона, последовательности IR / DR объединяются и удерживаются транспозазой в образовании синаптического комплекса (SCF). Формирование SCF является контрольной точкой, обеспечивающей правильное расщепление. HMGB1 не-гистон белок от хозяина, который связан с эукариотическим хроматином. Он усиливает предпочтительное связывание транспозазы с последовательностями IR / DR и, вероятно, необходим для образования / стабильности комплекса SCF. Транспозаза расщепляет ДНК в целевых сайтах, генерируя 3 'свесы. Затем фермент нацелен на ТА. динуклеотиды в геноме хозяина в качестве сайтов-мишеней для интеграции. Тот же самый ферментативный каталитический сайт, который расщепляет ДНК, отвечает за интеграцию ДНК в геном, дублируя при этом область генома. Хотя транспозаза специфична для динуклеотидов ТА, высокая частота этих пар в геноме указывает на то, что транспозон подвергается довольно случайной интеграции.[8]

Практическое применение

В результате способности транспозонного мутагенеза включать гены в большинство областей целевых хромосом, с этим процессом связан ряд функций.

  • Вирулентность гены вирусов и бактерий могут быть обнаружены путем нарушения генов и наблюдения за изменением фенотип. Это важно в антибиотик производство и борьба с болезнями.[4]
  • Несущественные гены могут быть обнаружены путем индукции мутагенеза транспозонов в организме. Затем трансформированные гены можно идентифицировать, выполнив ПЦР на восстановленный организм геном используя ORF -специфический грунтовка и специфический к транспозону праймер.[4] Поскольку транспозоны могут встраиваться в некодирующие области ДНК специфический праймер ORF гарантирует, что транспозон прервал ген. Потому что организм выжил после гомологичная интеграция, прерванный ген был явно несущественным.
  • Гены, вызывающие рак, можно идентифицировать с помощью полногеномного мутагенеза и скрининга мутантов, содержащих опухоли. Исходя из механизма и результатов мутации, рак -вызывающие гены можно идентифицировать как онкогены или же гены-супрессоры опухолей.[9]

Конкретные примеры

Микобактерии туберкулеза идентификация кластера генов вирулентности

В 1999 г. гены вирулентности, связанные с Микобактерии туберкулеза были идентифицированы с помощью транспозонов, опосредованных мутагенезом нокаут гена. Плазмида pCG113, содержащая канамицин гены устойчивости и ИС1096 Последовательность вставки была разработана так, чтобы содержать переменные теги из 80 пар оснований. Затем плазмиды трансформировали в М. туберкулез клетки электропорация. Колонии высевали на канамицин для отбора устойчивых клеток. Колонии, в которых произошли случайные события транспозиции, были идентифицированы БамЗДРАВСТВУЙ пищеварение и Саузерн-блоттинг с использованием внутренней ИС1096 ДНК-зонд. Колонии были проверены на ослабленный размножение для выявления колоний с мутациями в кандидатных генах вирулентности. Мутации, приводящие к ослаблению фенотипа, были нанесенный на карту к усиление регионов, прилегающих к ИС1096 последовательностей и сравнили с опубликованными М. туберкулез геном. В этом случае мутагенез транспозонов выявил 13 патогенный места в М. туберкулез геном, который ранее не был связан с заболеванием.[10] Это важная информация для понимания инфекционного цикла бактерии.

PiggyBac (PB) мутагенез транспозонов для открытия гена рака

В Свинка (PB) транспозон из капуста петлитель моль Трихоплюсия ni был разработан, чтобы быть высокоактивным в клетках млекопитающих и способным к мутагенезу в масштабе всего генома. Транспозоны содержали оба PB и Спящая красавица инвертированные повторы, чтобы распознаваться обеими транспозазами и увеличивать частоту транспозиции. Кроме того, транспозон содержал промотор и усилитель элементы, а донор и акцепторы сплайсинга чтобы допускать мутации с усилением или потерей функции в зависимости от ориентации транспозона и двунаправленные полиаденилирование сигналы. Транспозоны трансформировали в клетки мыши. in vitro и были проанализированы мутанты, содержащие опухоли. Механизм мутации, приводящей к образованию опухоли, определяли, был ли ген классифицирован как онкоген или ген-супрессор опухоли. Онкогены, как правило, характеризовались вставки в регионах, ведущих к сверхэкспрессии гена, тогда как гены-супрессоры опухолей были классифицированы как таковые на основании мутаций потери функции. Поскольку мышь является модельным организмом для изучения физиологии человека и болезней, это исследование поможет улучшить понимание генов, вызывающих рак, и потенциальных терапевтических целей.[9]

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ «Кормление голодных ртов». Биотехнологическая программа: Отчеты по проекту: Анализ генома. Европейская комиссия. 2001. 2-2.
  2. ^ а б c Seifert, H S; Чен, Э У; Итак, М; Хеффрон, Ф (1986-02-01). «Челночный мутагенез: метод мутагенеза транспозонов для Saccharomyces cerevisiae». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 83 (3): 735–739. Bibcode:1986ПНАС ... 83..735С. Дои:10.1073 / пнас.83.3.735. ISSN  0027-8424. ЧВК  322939. PMID  3003748.
  3. ^ Равиндран, Сандип (11 декабря 2012 г.). «Барбара МакКлинток и открытие прыгающих генов». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 109 (50): 20198–20199. Дои:10.1073 / pnas.1219372109. ISSN  1091-6490. ЧВК  3528533. PMID  23236127.
  4. ^ а б c Хамер, Лизбет; ДеЗваан, Тодд М; Черногория-Чаморро, Мария Виктория; Фрэнк, Шерил А; Хамер, Джон Э (2001-02-01). «Последние достижения в крупномасштабном мутагенезе транспозонов». Современное мнение в области химической биологии. 5 (1): 67–73. Дои:10.1016 / S1367-5931 (00) 00162-9. PMID  11166651.
  5. ^ а б Шкипер, Кристиан А .; Андерсен, Питер Р .; Шарма, Нинн; Миккельсен, Якоб Г. (09.12.2013). «Генные носители на основе транспозонов ДНК - сцены из эволюционного движения». Журнал биомедицинских наук. 20 (1): 92. Дои:10.1186/1423-0127-20-92. ISSN  1423-0127. ЧВК  3878927. PMID  24320156.
  6. ^ а б c d Резникофф, В. С. (1 января 1993 г.). «Транспозон Tn5». Ежегодный обзор микробиологии. 47: 945–963. Дои:10.1146 / annurev.mi.47.100193.004501. ISSN  0066-4227. PMID  7504907.
  7. ^ Матес, Лайош; Чуах, Марин К. Л.; Страховка, Эяю; Джерчоу, Борис; Манодж, Намитха; Акоста-Санчес, Абель; Grzela, Dawid P; Шмитт, Андреа; Беккер, Катя (июнь 2009 г.). «Молекулярная эволюция новой гиперактивной транспозазы Спящей красавицы обеспечивает надежный и стабильный перенос генов у позвоночных». Природа Генетика. 41 (6): 753–761. Дои:10,1038 / нг.343. PMID  19412179.
  8. ^ Ижвак, Жужанна; Ивиц, Золтан (1 февраля 2004 г.). «Транспозиция« Спящей красавицы »: биология и применение». Молекулярная терапия. 9 (2): 147–156. Дои:10.1016 / j.ymthe.2003.11.009. ISSN  1525-0016. PMID  14759798.
  9. ^ а б Рад, Роланд; Рад, Лена; Ван, Вэй; Кадинанос, Хуан; Василиу, Джордж; Райс, Стивен; Campos, Lia S .; Юса, Косуке; Банерджи, Руби (19 ноября 2010 г.). "Мутагенез транспозонов PiggyBac: инструмент для открытия раковых генов у мышей". Наука. 330 (6007): 1104–1107. Bibcode:2010Научный ... 330.1104R. Дои:10.1126 / science.1193004. ISSN  0036-8075. ЧВК  3719098. PMID  20947725.
  10. ^ Камачо, Луис Рейнальдо; Ensergueix, Danielle; Перес, Эстер; Жикель, Бриджит; Гильо, Кристоф (1999-10-01). «Идентификация кластера генов вирулентности Mycobacterium tuberculosis с помощью сигнатурного транспозонного мутагенеза». Молекулярная микробиология. 34 (2): 257–267. Дои:10.1046 / j.1365-2958.1999.01593.x. ISSN  1365-2958. PMID  10564470.

внешняя ссылка