Система транспозонов "Спящая красавица" - Sleeping Beauty transposon system

В Спящая красавица транспозонная система синтетическая ДНК транспозон разработан, чтобы ввести точно определенные ДНК последовательности в хромосомы из позвоночное животное животных в целях внедрения новых черты и открыть для себя новые гены и их функции. Это Tc1 / моряк -типа, с транспозазой, воскрешенной из нескольких неактивных последовательностей рыб.

Механизм действия

Рисунок 1. Механизм SB-опосредованной транспозиции.
Верхняя строка: Транспозон, обозначенный зеркальными наборами красных двойных стрелок (IR / DR), показан как содержащийся в другой молекуле ДНК (например, плазмиде, показанной синими линиями). Транспозон в этом примере содержит кассету экспрессии, состоящую из промотора (синий овал), который может управлять транскрипцией гена или другой последовательности ДНК, помеченной как «генетический груз». Средние строки: Спящая красавица (SB) транспозаза связывается с IR / DR, как показано, и вырезает транспозон из плазмиды (участки вырезания указаны двумя черными пунктирными линиями в оставшейся плазмиде) Две нижние строчки: Другая молекула ДНК (зеленая) с последовательностью ТА может стать реципиентом транспонированного транспозона. При этом последовательность ТА в сайте вставки дублируется.

В Спящая красавица транспозонная система состоит из Спящая красавица (SB) транспозаза и транспозон который был разработан в 1997 году для вставки определенных последовательностей ДНК в геномы позвоночных животных. Транспозоны ДНК перемещаются с одного участка ДНК на другой простым способом вырезания и вставки (рис. 1). Транспозиция - это точный процесс, при котором определенный сегмент ДНК вырезается из одной молекулы ДНК и перемещается в другой сайт в той же или другой молекуле ДНК или геном.[1]

Как и все другие Tc1 / моряк транспозазы -типа, транспозаза SB вставляет транспозон в динуклеотид ТА базовая пара в последовательности ДНК реципиента.[2] Сайт вставки может находиться в другом месте той же молекулы ДНК или в другой молекуле ДНК (или хромосоме). В геномах млекопитающих, в том числе человека, насчитывается около 200 миллионов сайтов ТА. Сайт вставки ТА дублируется в процессе интеграции транспозона. Это дублирование последовательности ТА является отличительным признаком транспозиции и используется для выяснения механизма в некоторых экспериментах. Однако недавнее исследование показало, что SB также с низкой частотой интегрируется в динуклеотиды, не являющиеся TA.[3]. Транспозаза может быть закодирована либо внутри транспозона (например, предполагаемый транспозон, показанный на фиг.2), либо транспозаза может быть предоставлена ​​другим источником, и в этом случае транспозон становится неавтономным элементом. Неавтономные транспозоны (например, рис. 1) наиболее полезны в качестве генетических инструментов, потому что после вставки они не могут независимо продолжать вырезать и повторно вставлять. Все ДНК-транспозоны, идентифицированные в геноме человека и других геномах млекопитающих, не автономны, потому что, даже если они содержат гены транспозаз, эти гены нефункциональны и не могут генерировать транспозазу, которая может мобилизовать транспозон.

Строительство

Рисунок 2: Структурные особенности транспозазы SB.
Полипептид из 360 аминокислот имеет три основных субдомена: аминоконцевой домен распознавания ДНК, который отвечает за связывание с последовательностями DR в зеркальных последовательностях IR / DR транспозона, последовательность ядерной локализации (NLS) и DDE. домен, который катализирует набор реакций, которые включают транспозицию. Домен распознавания ДНК имеет два парный последовательности боксов, которые могут связываться с ДНК и связаны с различными мотивами, обнаруженными на некоторых факторах транскрипции; два парный коробки помечены как PAI и RED. Каталитический домен имеет характерные аминокислоты DDE (иногда DDD), которые обнаруживаются во многих ферментах транспозаз и рекомбиназ. Кроме того, есть область, которая сильно обогащена аминокислотами глицина (G).

Этот воскрешенный ген транспозазы был назван "Спящая красавица (SB)"потому что он вернулся к активности после долгого эволюционного сна.[4] Система транспозонов SB является синтетической в ​​том смысле, что транспозаза SB была реконструирована из вымерших (ископаемых) последовательностей транспозаз, принадлежащих к классу транспозонов Tc1 / mariner.[5][6] обнаружен в геномах лососевых рыб.[7] Как и у людей, где около 20000 инактивированных транспозонов типа Tc1 / mariner составляют почти 3% человеческий геном,[8][9] гены транспозаз, обнаруженные у рыб, неактивны более 10 миллионов лет из-за накопившихся мутаций. Реконструкция SB-транспозазы была основана на представлении о существовании первичного Tc1-подобного транспозона, который был предком последовательностей, обнаруженных в геномах рыб. Хотя было много последовательностей, которые выглядели как транспозоны Tc-1 во всех изученных геномах рыб, все последовательности транспозонов были неактивными из-за мутаций. Предполагая, что вариации в последовательностях были вызваны независимыми мутациями, которые накапливались в различных транспозонах, был постулирован предполагаемый наследственный транспозон (рис. 2).[10]

Конструирование транспозазы началось со слияния частей двух неактивных последовательностей транспозонов из Атлантический лосось (Salmo salar) и одну неактивную последовательность транспозона из радужная форель (Oncorhynchus mykiss), а затем устранение небольших дефицитов в функциональных доменах транспозазы фермент (Рис. 3). Каждый аминокислота в первой завершенной транспозазе, называемой SB10, определялась «правилом большинства». консенсус последовательность »на основе 12 частичных генов, обнаруженных у восьми видов рыб. Первые шаги (1-> 3 на рис. 3) заключались в восстановлении полного белка путем заполнения пробелов в последовательности и изменения кодонов терминации, которые препятствовали бы синтезу предполагаемого полипептида из 360 аминокислот. Следующим шагом (4 на рис. 3) было обратить мутации в сигнал ядерной локализации (NLS), который необходим для импорта фермента транспозазы из цитоплазма где это сделано для ядро где он действует. Амино-конец транспозазы, который содержит ДНК-связывающие мотивы для распознавания прямых повторов (DR), был восстановлен на этапах 5-> 8. Последние два шага восстановили каталитический домен, в котором сохранились особенности. аспарагиновая кислота (D) и глютаминовая кислота (E) аминокислоты с определенным интервалом, которые встречаются в интегрирует и рекомбиназы.[11] Конечным результатом стал SB10, содержащий все мотивы, необходимые для функционирования.[4]

Рисунок 3. Конструкция SB транспозазы.
Шаг 1: Схема вымершего Tc1 / моряк-подобные транспозоны в геномах современных лососевых; х - миссенс-мутации; S - терминационные мутации; F - мутации сдвига рамки считывания; G, значительный пробел / недостающие аминокислоты.
Шаг 3: Устранение разрыва (G) и мутаций терминации и сдвига рамки считывания.
Шаг 4: реконструкция двудольной последовательности NLS (оранжевое подчеркивание).
Этапы 5–8: реконструкция N-концевого ДНК-связывающего домена (оранжевое подчеркивание).
Этапы 9–10: реконструкция каталитического домена (оранжевое подчеркивание), включая сигнатурные остатки DDE (зеленые прямоугольники).

Транспозаза SB10 была усовершенствована за десять лет с момента ее создания за счет увеличения консенсуса с большим количеством потухших последовательностей транспозона Tc1 и тестирования различных комбинаций изменений.[12][13][14][15][16][17] Дальнейшая работа показала, что ДНК-связывающий домен состоит из двух парных последовательностей, которые гомологичны мотивам последовательностей, обнаруженным в некоторых факторах транскрипции. Парные субдомены в транспозазе SB были обозначены как PAI и RED. Субдомен PAI играет доминирующую роль в распознавании последовательностей DR в транспозоне. Субдомен RED перекрывается с сигналом ядерной локализации, но его функция остается неясной.[18] Самая последняя версия SB-транспозазы, SB100X, примерно в 100 раз превышает активность SB10, как было определено с помощью анализов транспозиции генов устойчивости к антибиотикам, проведенных в культивируемых тканях человеческих клетках HeLa.[16] Международное общество молекулярной и клеточной биологии и биотехнологических протоколов и исследований (ISMCBBPR) назвало SB100X молекулой года на 2009 год за признание его потенциала в будущей геномной инженерии.[19]

Транспозон, распознаваемый транспозазой SB, был назван Т, потому что он был выделен из генома другой лососевой рыбы, Танихтис альбонубес. Транспозон состоит из интересующей генетической последовательности, фланкированной перевернутые повторы (IR), которые сами содержат короткие прямые повторы (DR) (тандемные стрелки IR-DR на фиг. 1 и 2). T имел последовательность IR / DR, ближайшую к консенсусной последовательности для вымерших Tc-1-подобных транспозонов у рыб. Консенсусный транспозон имеет IR из 231 пары оснований. Самые внутренние DR имеют длину 29 пар оснований, тогда как самые внешние DR имеют длину 31 пару оснований. Разница в длине критична для максимальной скорости транспозиции.[20] Исходный компонент Т-транспозона системы транспозонов SB был улучшен с небольшими изменениями, чтобы соответствовать консенсусу многих родственных вымерших и активных транспозонов.[20][21]

Приложения

Рисунок 4: Использование Спящая красавица транспозонная система

За последнее десятилетие транспозоны SB были разработаны как невирусные векторы для введения генов в геномы позвоночных животных и для генная терапия. Генетический груз может быть кассета экспрессии —А трансген и связанные элементы, которые придают транскрипционная регуляция для экспрессии на желаемом уровне в конкретной ткани (ах). Альтернативное использование транспозонов SB - обнаружение функций генов, особенно тех, которые вызывают рак,[22][23] путем доставки последовательностей ДНК, которые максимально нарушают экспрессию генов, близких к сайту встраивания. Этот процесс называется инсерционный мутагенез или же транспозонный мутагенез. Когда ген инактивируется вставкой транспозона (или другим механизмом), этот ген «нокаутируется». Нокаут-мыши и нокаутные крысы были сделаны с системой SB.[24][25] Рисунок 4 иллюстрирует эти два использования транспозонов SB.

SB транспозоны сочетают в себе преимущества вирусов и «голой» ДНК как для доставки генов, так и для их разрушения. Вирусы были выбраны эволюционным путем на основе их способности инфицировать и размножаться в новых клетках-хозяевах. Одновременно в клетках выработались основные механизмы молекулярной защиты, чтобы защитить себя от вирусных инфекций. Для некоторых приложений геномной инженерии, таких как некоторые формы генной терапии,[26][27][28] отказ от использования вирусов также важен по социальным и нормативным причинам. Использование невирусных векторов позволяет избежать многих, но не всех защитных механизмов, которые клетки используют против векторов.

Плазмиды кольцевые ДНК, показанные на фиг. 1, обычно используются для доставки невирусных генов. Однако есть две основные проблемы с большинством методов доставки ДНК к клеточным хромосомам с использованием плазмид, наиболее распространенной формы невирусной доставки генов. Во-первых, экспрессия трансгенов из плазмид непродолжительна из-за отсутствия интеграции и из-за клеточных ответов, которые выключают экспрессию. Во-вторых, проникновение плазмидных молекул в клетки затруднено и неэффективно. Система транспозонов "Спящей красавицы" была разработана для решения первой проблемы. Транспозоны ДНК точно вставляют определенные последовательности ДНК (рис. 1) почти случайным образом в геномы хозяина, тем самым увеличивая продолжительность экспрессии генов (даже через несколько поколений). Более того, транспозиция позволяет избежать образования множественных тандемных интеграций, которые часто приводят к выключению экспрессии трансгена. В настоящее время внедрение трансгенов в хромосомы с помощью плазмид намного менее эффективно, чем с использованием вирусов. Однако при использовании мощных промоторов для регуляции экспрессии трансгена доставка транспозонов в несколько клеток может обеспечить полезные уровни секретируемых генных продуктов для всего животного.[29][30]

Возможно, самое захватывающее потенциальное применение Спящая красавица транспозоны будут использоваться для генной терапии человека. Можно предвидеть широкое распространение генной терапии людьми в странах первого мира, а также в странах с развивающейся экономикой, если стоимость системы переносчиков будет доступной. Поскольку система SB состоит исключительно из ДНК, стоимость производства и доставки значительно снижается по сравнению с вирусными векторами. Первые клинические испытания с использованием транспозонов SB в генетически модифицированных Т-клетках будут проверять эффективность этой формы генной терапии у пациентов с риском смерти от прогрессирующих злокачественных новообразований.[31]

Рекомендации

  1. ^ Plasterk RH (сентябрь 1993 г.). «Молекулярные механизмы транспозиции и ее контроль». Клетка. 74 (5): 781–786. Дои:10.1016/0092-8674(93)90458-3. PMID  8397072.
  2. ^ Plasterk RH, Izsvák Z, Ivics Z (август 1999 г.). «Иностранцы-резиденты: надсемейство мобильных элементов Tc1 / mariner». Тенденции Genet. 15 (8): 326–332. Дои:10.1016 / S0168-9525 (99) 01777-1. PMID  10431195.
  3. ^ Го, Ябинь; Чжан, Инь; Ху, Кайсунь (2018). "Транспозон" Спящей красавицы "интегрируется в динуклеотиды, не относящиеся к ТА". Мобильная ДНК. 9: 8. Дои:10.1186 / s13100-018-0113-8. ЧВК  5801840. PMID  29445422.
  4. ^ а б Ivics Z, Hackett PB, Plasterk RH, Izsvák Z (ноябрь 1997 г.). «Молекулярная реконструкция Спящей красавицы, Tc1-подобного транспозона из рыб, и его транспозиция в человеческих клетках». Клетка. 91 (4): 501–510. Дои:10.1016 / S0092-8674 (00) 80436-5. PMID  9390559.
  5. ^ Доак Т. Г., Доердер Ф. П., Ян К. Л., Херрик Г. (февраль 1994 г.). «Предлагаемое суперсемейство генов транспозаз: транспозоноподобные элементы у реснитчатых простейших и общий мотив« D35E »». Proc. Natl. Акад. Sci. СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ. 91 (3): 942–946. Bibcode:1994PNAS ... 91..942D. Дои:10.1073 / пнас.91.3.942. ЧВК  521429. PMID  8302872.
  6. ^ Radice AD, Bugaj B., Fitch DH, Emmons SW (сентябрь 1994 г.). «Широкое распространение семейства транспозонов Tc1: Tc1-подобные транспозоны костистых рыб». Мол. Генерал Жене. 244 (6): 606–12. Дои:10.1007 / bf00282750. PMID  7969029.
  7. ^ Гудье Дж. Л., Дэвидсон В. С. (1994). «Генное картирование у рыб». В Hochachka PW, Mommsen TP (ред.). Биохимия и молекулярная биология рыб. 2. Амстердам: Эльзевир. С. 93–112. ISBN  0-444-82032-9.
  8. ^ Вентер Дж. К., Адамс, доктор медицины, Майерс Э. У. и др. (Февраль 2001 г.). «Последовательность генома человека». Наука. 291 (5507): 1304–51. Bibcode:2001Научный ... 291.1304V. Дои:10.1126 / science.1058040. PMID  11181995.
  9. ^ Лендер Э.С., Линтон Л.М., Биррен Б. и др. (Февраль 2001 г.). "Начальная последовательность и анализ человеческого генома" (PDF). Природа. 409 (6822): 860–921. Bibcode:2001Натура.409..860л. Дои:10.1038/35057062. PMID  11237011.
  10. ^ Ivics Z, Izsvak Z, Minter A, Hackett PB (май 1996 г.). «Идентификация функциональных доменов и эволюция Tc1-подобных мобильных элементов». Proc. Natl. Акад. Sci. СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ. 93 (10): 5008–5013. Bibcode:1996PNAS ... 93.5008I. Дои:10.1073 / pnas.93.10.5008. ЧВК  39397. PMID  8643520.
  11. ^ Крейг Н.Л. (октябрь 1995 г.). «Единство в реакциях транспозиции». Наука. 270 (5234): 253–4. Bibcode:1995 Наука ... 270..253C. Дои:10.1126 / science.270.5234.253. PMID  7569973.
  12. ^ Geurts AM, Yang Y, Clark KJ, Liu G, Cui Z, Dupuy AJ, Bell JB, Largaespada DA, Hackett PB (июль 2003 г.). «Перенос генов в геномы клеток человека с помощью транспозонной системы спящей красавицы». Мол. Ther. 8 (1): 108–117. Дои:10.1016 / S1525-0016 (03) 00099-6. PMID  12842434.
  13. ^ Zayed H, Izsvák Z, Walisko O, Ivics Z (февраль 2004 г.). «Разработка гиперактивных транспозонов спящей красавицы с помощью мутационного анализа». Мол. Ther. 9 (2): 292–304. Дои:10.1016 / j.ymthe.2003.11.024. PMID  14759813.
  14. ^ Янт С.Р., Пак Дж., Хуанг Й., Миккельсен Дж. Г., Кей М.А. (октябрь 2004 г.). «Мутационный анализ N-концевого ДНК-связывающего домена транспозазы спящей красавицы: критические остатки для связывания ДНК и гиперактивности в клетках млекопитающих». Мол. Клетка. Биол. 24 (20): 9239–9247. Дои:10.1128 / MCB.24.20.9239-9247.2004. ЧВК  517896. PMID  15456893.
  15. ^ Баус Дж., Лю Л., Хеггестад А.Д., Санс С., Флетчер Б.С. (декабрь 2005 г.). «Гиперактивные транспозазные мутанты транспозона Спящей красавицы». Мол. Ther. 12 (6): 1148–1156. Дои:10.1016 / j.ymthe.2005.06.484. PMID  16150650.
  16. ^ а б Матес Л., Чуах М.К., Белэй Э, Джерчоу Б., Манодж Н., Акоста-Санчес А., Грзела Д.П., Шмитт А., Беккер К., Матрай Дж., Ма Л., Самара-Куко Э., Гисеманс К., Припутневич Д., Миски К. Б., VandenDriessche T., Ivics Z, Izsvák Z (июнь 2009 г.). «Молекулярная эволюция новой гиперактивной транспозазы Спящей красавицы обеспечивает надежный стабильный перенос генов у позвоночных». Nat. Genet. 41 (6): 753–761. Дои:10,1038 / нг.343. PMID  19412179.
  17. ^ Grabundzija I., Irgang M, Mátés L, Belay E, Matrai J, Gogol-Döring A, Kawakami K, Chen W., Ruiz P, Chuah MK, VandenDriessche T., Izsvák Z, Ivics Z (июнь 2010 г.). «Сравнительный анализ векторных систем мобильных элементов в клетках человека». Мол. Ther. 18 (6): 1200–1209. Дои:10.1038 / мт.2010.47. ЧВК  2889740. PMID  20372108.
  18. ^ Izsvák Z, Khare D, Behlke J, Heinemann U, Plasterk RH, Ivics Z (сентябрь 2002 г.). «Вовлечение бифункционального, парно-подобного ДНК-связывающего домена и усилителя транспозиции в транспозицию« Спящей красавицы »». J. Biol. Chem. 277 (37): 34581–34588. Дои:10.1074 / jbc.M204001200. PMID  12082109.
  19. ^ Венс Т. """Спящая красавица" "названа молекулой года". mdc-berlin.de. Получено 10 мая 2011.
  20. ^ а б Cui Z, Geurts AM, Liu G, Kaufman CD, Hackett PB (май 2002 г.). «Структурно-функциональный анализ инвертированных концевых повторов транспозона спящей красавицы». J. Mol. Биол. 318 (5): 1221–1235. Дои:10.1016 / S0022-2836 (02) 00237-1. PMID  12083513.
  21. ^ Izsvák Z, Ivics Z, Plasterk RH (сентябрь 2000 г.). «Спящая красавица, транспозонный вектор широкого диапазона хозяев для генетической трансформации позвоночных». J. Mol. Биол. 302 (1): 93–102. Дои:10.1006 / jmbi.2000.4047. PMID  10964563.
  22. ^ Карлсон К.М., Ларгаэспада Д.А. (июль 2005 г.). «Инсерционный мутагенез у мышей: новые перспективы и инструменты». Nat. Преподобный Жене. 6 (7): 568–580. Дои:10.1038 / nrg1638. PMID  15995698.
  23. ^ Дюпюи А.Дж. (август 2010 г.). «Скрининг на основе транспозонов для обнаружения раковых генов на моделях мышей». Семин. Рак Биол. 20 (4): 261–268. Дои:10.1016 / j.semcancer.2010.05.003. ЧВК  2940989. PMID  20478384.
  24. ^ Ivics Z, Izsvák Z (январь 2005 г.). "Целая куча прыгунов: новые инструменты транспозонов для функциональной геномики позвоночных". Тенденции Genet. 21 (1): 8–11. Дои:10.1016 / j.tig.2004.11.008. PMID  15680506.
  25. ^ Джейкоб Х.Дж., Лазар Дж., Двинелл М.Р., Морено К., Гертс А.М. (декабрь 2010 г.). «Нацеливание на гены у крысы: достижения и возможности». Тенденции Genet. 26 (12): 510–518. Дои:10.1016 / j.tig.2010.08.006. ЧВК  2991520. PMID  20869786.
  26. ^ Izsvák Z, Ivics Z (февраль 2004 г.). «Транспозиция спящей красавицы: биология и приложения для молекулярной терапии». Мол. Ther. 9 (2): 147–156. Дои:10.1016 / j.ymthe.2003.11.009. PMID  14759798.
  27. ^ Hackett PB, Ekker SC, Largaespada DA, McIvor RS (2005). "Спящая красавица, опосредованная транспозоном генная терапия для пролонгированной экспрессии". Adv. Genet. Успехи в генетике. 54: 189–232. Дои:10.1016 / S0065-2660 (05) 54009-4. ISBN  978-0-12-017654-0. PMID  16096013.
  28. ^ Аронович Е.Л., Скотт Макайвор Р., Хакетт ПБ (апрель 2011 г.). «Система транспозонов Спящей красавицы: невирусный вектор для генной терапии». Хум Мол Генет. 20 (R1): R14 – R20. Дои:10,1093 / hmg / ddr140. ЧВК  3095056. PMID  21459777.
  29. ^ Аронович Е.Л., Белл Дж. Б., Белур Л. Р., Гюнтер Р., Коньяр Б., Эриксон, округ Колумбия, Шачерн П. А., Матиз И., Макайвор Р. С., Уитли С. Б., Хакетт ПБ (май 2007 г.). «Длительная экспрессия лизосомального фермента в печени мышей после доставки гена, опосредованной транспозоном Sleeping Beauty: последствия для невирусной генной терапии мукополисахаридозов». Дж. Джин Мед. 9 (5): 403–415. Дои:10.1002 / jgm.1028. ЧВК  1868578. PMID  17407189.
  30. ^ Аронович Е.Л., Белл Д. «Системная коррекция болезни накопления у мышей MPS I NOD / SCID с использованием транспозонной системы спящей красавицы». Мол. Ther. 17 (7): 1136–1144. Дои:10,1038 / мт.2009,87. ЧВК  2835207. PMID  19384290.
  31. ^ Hackett PB, Largaespada DA, Cooper LJ (апрель 2010 г.). «Транспозон и система транспозаз для человеческого применения». Мол. Ther. 18 (4): 674–683. Дои:10.1038 / мт.2010.2. ЧВК  2862530. PMID  20104209.