Вставной мутагенез - Insertional mutagenesis

В молекулярная биология, инсерционный мутагенез это создание мутации ДНК путем добавления одного или нескольких пар оснований. Такие инсерционные мутации могут возникать естественным путем, опосредованно: вирусы или же транспозоны, или могут быть созданы искусственно для исследовательских целей в лаборатории.

Сигнатурный меченый мутагенез

Основная статья: Сигнатурный мутагенез

Это метод, используемый для изучения функции гены. А транспозон такой как Элемент P из Drosophila melanogaster разрешено интегрировать в случайных местах в геном исследуемого организма. Затем мутанты, полученные этим методом, проверяются на любые необычные фенотипы. Если такой фенотип обнаружен, то можно предположить, что вставка вызвала инактивацию гена, относящегося к обычному фенотипу. Поскольку последовательность транспозона известна, ген можно идентифицировать либо путем секвенирования всего генома и поиска последовательности, либо с помощью полимеразной цепной реакции чтобы усилить именно этот ген.

Инсерционный мутагенез вируса

Поскольку многие вирусы интегрируют свои собственные геномы в геномы своих клеток-хозяев для репликации, мутагенез, вызванный вирусными инфекциями, является довольно распространенным явлением. Однако не все интегрирующие вирусы вызывают инсерционный мутагенез.

Некоторые вставки ДНК не приведут к заметной мутации. В недавних испытаниях генной терапии лентивирусный векторов используемый для вставки терапевтической ДНК, не показал тенденции к нарушению функции генов или стимулированию онкогенный разработка.[1][2] Благодаря этим достижениям в настоящее время считается безопасным использование таких интегрирующих векторов для генной терапии. Преимущество состоит в том, что лентивирусные векторы интегрируют ДНК постоянно, тогда как действие других, неинтегрирующих вирусов является временным. Для таких вирусов, как гаммаретровирусы которые имеют тенденцию интегрировать свою ДНК в генетически неблагоприятных местах, серьезность любой последующей мутации полностью зависит от того места в геноме хозяина, в которое встроена вирусная ДНК. Если ДНК вставить в середину важного гена, воздействие на клетку будет серьезным. Кроме того, вставка в ген промоутер регион могут иметь столь же сильные последствия. Аналогичным образом, если вирусная ДНК вставлена ​​в репрессор соответствующий ген промотора может быть сверхэкспрессирован, что приводит к переизбытку его продукта и изменению клеточной активности. Если ДНК вставлена ​​в ген энхансерная область, ген может быть недоэкспрессирован, что приводит к относительному отсутствию его продукта, что может значительно нарушить активность клетки.

Изменение разных генов по-разному влияет на клетку. Не все мутации существенно влияют на пролиферацию клетки. Однако, если вставка происходит в важном гене или гене, который участвует в клеточная репликация или же запрограммированная гибель клеток вставка может поставить под угрозу жизнеспособность клетки или даже вызвать бесконечную репликацию клетки, что приведет к образованию опухоли, которая может стать злокачественной.

Инсерционный мутагенез возможен независимо от того, относится ли вирус к самоинактивирующемуся типу, обычно используемому в генной терапии, или он способен к репликации. Вирус встраивает ген (известный как вирусный онкоген) обычно рядом с клеточным геном myc (c-myc). В c-myc ген в клетке обычно выключен; однако, когда он включен, он может протолкнуть ячейку в Фаза G1 из клеточный цикл и заставляют клетку начать репликацию, вызывая неконтролируемую пролиферацию клеток, позволяя реплицировать вирусный ген. После многих репликаций, когда вирусный ген остается, латентные опухоли начинают расти. Эти опухоли обычно происходят от одного мутировавшего /преобразованный клетка (клональная по происхождению). Вирус птичьего лейкоза является примером вируса, вызывающего заболевание путем инсерционного мутагенеза. Только что вылупившиеся цыплята, инфицированные вирусом птичьего лейкоза, начинают образовывать опухоли, которые начинают появляться в их тканевой сумке (например, в тимусе человека). Эта вставка вирусного гена также известна как вставка промотора, поскольку она управляет экспрессией гена c-myc. Вот пример инсерционного мутагенеза, вызванного ретротранспозон в геноме человека, где он вызывает мышечную дистрофию типа Фукуяма.[3]

Инсерционная инактивация

Инсерционная инактивация это техника, используемая в рекомбинантная ДНК инженерия, где плазмида (например, pBR322 )[4] используется для отключения экспрессии гена.[5]

Инактивация гена путем вставки фрагмента ДНК в середину его кодирующей последовательности. Любые будущие продукты из инактивированного гена не будут работать из-за добавленных к нему дополнительных кодов. Примером является использование pBR322, которая имеет гены, которые соответственно кодируют полипептиды, которые придают устойчивость к антибиотикам ампициллина и тетрациклина. Следовательно, когда генетическая область прерывается интеграцией pBR322, функция гена теряется, но приобретается новая функция гена (устойчивость к специфическим антибиотикам).

Альтернативная стратегия инсерционного мутагенеза была использована у позвоночных животных для поиска генов, вызывающих рак. В этом случае транспозон, например Спящая красавица, разработан, чтобы прервать работу гена таким образом, чтобы вызвать максимальный генетический ущерб. В частности, транспозон содержит сигналы для усечения экспрессии прерванного гена в месте вставки и затем возобновления экспрессии второго усеченного гена. Этот метод использовался для идентификации онкогены.[6][7]

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ Biffi A и др., Генная терапия лентивирусными гемопоэтическими стволовыми клетками способствует метахроматической лейкодистрофии. Наука. 2013 23 августа; 341 (6148): 1233158.
  2. ^ Айути А. и др. Лентивирусная генная терапия гемопоэтическими стволовыми клетками у пациентов с синдромом Вискотта-Олдрича. Наука. 23 августа 2013 г .; 341 (6148): 1233151
  3. ^ «Ретровирусы». Архивировано из оригинал 4 мая 2015 года.
  4. ^ «Рекомбинантная ДНК». Архивировано из оригинал на 2012-08-05. Получено 2010-04-11.
  5. ^ «Инсерционная инактивация». Архивировано из оригинал на 2009-02-18. Получено 2010-04-11.
  6. ^ Карлсон К.М., Ларгаэспада Д.А. (июль 2005 г.). «Инсерционный мутагенез у мышей: новые перспективы и инструменты». Nat. Преподобный Жене. 6 (7): 568–80. Дои:10.1038 / nrg1638. PMID  15995698.
  7. ^ Ivics Z, Izsvák Z (2004). «Мобильные элементы для трансгенеза и инсерционного мутагенеза у позвоночных: современный обзор экспериментальных стратегий». Методы Мол. Биол. 260: 255–76. Дои:10.1385/1-59259-755-6:255. PMID  15020812.

внешняя ссылка