Мутагенез с насыщением последовательностей - Википедия - Sequence saturation mutagenesis

Мутагенез с насыщением последовательностей (SeSaM) является химио-ферментативным случайный мутагенез метод, применяемый для направленная эволюция из белки и ферменты.[нужна цитата ] Это один из самых распространенных методы мутагенеза с насыщением. Через четыре ПЦР -основанные стадии реакции, фосфоротиоат нуклеотиды вставлены в ген последовательность, расщепленная и полученные фрагменты удлинены универсальным или вырожденным нуклеотиды. Затем эти нуклеотиды заменяются стандартными нуклеотидами, что обеспечивает широкое распространение мутаций нуклеиновых кислот по последовательности гена с предпочтением трансверсий и с особым вниманием к последовательным точечным мутациям, которые трудно создать с помощью других методов мутагенеза. Методика была разработана профессором Ульрихом Шванебергом в Университет Якобса в Бремене и RWTH Ахенский университет.

Технологии, развитие и преимущества

SeSaM был разработан для того, чтобы преодолеть несколько основных ограничений, возникающих при работе со стандартными методами мутагенеза, основанными на простых методах ПЦР, подверженных ошибкам (epPCR). Эти методы эпПЦР основаны на использовании полимеразы и, таким образом, сталкиваются с ограничениями, которые в основном возникают из-за того обстоятельства, что выполняются только одиночные, но очень редко последовательные замены нуклеиновых кислот и что эти замены обычно происходят только в определенных, предпочтительных положениях. Кроме того, трансверсии нуклеиновых кислот гораздо реже, чем переходы и требуют специально разработанных полимераз с измененным предвзятость.[1] Эти характеристики катализируемых epPCR обменов нуклеиновых кислот вместе с тем фактом, что генетический код выродившийся уменьшить результирующее разнообразие на аминокислота уровень. Синонимичные замены привести к сохранению аминокислот или консервативные мутации со схожими физико-химическими свойствами, такими как размер и гидрофобность широко распространены.[2][3] Посредством неспецифического введения универсальных оснований в каждое положение в последовательности гена SeSaM преодолевает предвзятость полимеразы, благоприятствуя временным заменам в определенных положениях, но открывает полную последовательность гена для разнообразного набора аминокислотных замен.[4]

Сравнение паттерна аминокислотных замен, полученного с использованием стандартных методов epPCR (одиночные нуклеотидные замены со смещением перехода) и метода мутагенеза с насыщением последовательности (введение последовательных нуклеотидных замен с повышенным соотношением трансверсий).

При разработке SeSaM-метода было внесено несколько модификаций, позволяющих вводить несколько мутаций одновременно.[5] Еще одним достижением метода стало введение вырожденных оснований вместо универсальных. инозин и использование оптимизированных ДНК-полимераз, что дополнительно увеличивает соотношение введенных трансверсий.[6] Этот модифицированный метод SeSaM-TV +, кроме того, позволяет и способствует введению двух последовательных замен нуклеотидов, сильно расширяя спектр аминокислот, которые могут быть заменены.

Путем нескольких оптимизаций, включая применение улучшенного химера полимераза на этапе III метода SeSaM-TV-II [7][8] и добавление альтернативного вырожденного нуклеотида для эффективной замены оснований тимина и цитозина и увеличения частоты мутаций в SeSaM-P / R,[9] сгенерированные библиотеки были дополнительно улучшены в отношении числа трансверсий, и количество последовательных мутаций было увеличено до 2–4 последовательных мутаций со скоростью последовательных мутаций до 30%.[10]

Процедура

SeSaM-метод состоит из четырех этапов на основе ПЦР, которые можно выполнить в течение двух-трех дней. Основные части включают включение фосфоротиоатных нуклеотидов, химическую фрагментацию в этих положениях, введение универсальных или вырожденных оснований и их замену на точечные мутации вставки природных нуклеотидов.

Экспериментальные шаги для создания библиотеки непредвзятого случайного мутагенеза с использованием метода мутагенеза с насыщением последовательностей.

Первоначально универсальные последовательности «SeSaM» вставляются с помощью ПЦР со связыванием ген-специфических праймеров перед и за интересующим геном. Представляющий интерес ген с его фланкирующими областями амплифицируется для введения этих последовательностей SeSaM_fwd и SeSaM_rev и для создания матрицы для последовательных этапов ПЦР.

Эти сгенерированные так называемые шаблоны fwd и rev теперь амплифицируются в реакции ПЦР с заранее определенной смесью фосфоротиоатных и стандартных нуклеотидов для обеспечения равномерного распределения встроенных мутаций по всей длине гена. Продукты ПЦР этапа 1 специфически расщепляются по фосфоротиоатным связям, образуя пул одноцепочечных фрагментов ДНК разной длины, начиная с универсального праймера.

На этапе 2 SeSaM одиночные цепи ДНК удлиняются на одно или несколько универсальных или вырожденных оснований (в зависимости от модификации применяемого SeSaM), что катализируется терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза (TdT). Этот шаг является ключевым для введения характерных последовательных мутаций для случайного изменения целых кодонов.

Затем на этапе 3 выполняется ПЦР, рекомбинируя одноцепочечные фрагменты ДНК с соответствующей полноразмерной обратной матрицей, генерируя полноразмерный двухцепочечный ген, включающий универсальные или вырожденные основания в своей последовательности.

Путем замены универсальных / вырожденных оснований в последовательности гена случайными стандартными нуклеотидами на этапе 4 SeSaM генерируется разнообразный массив полноразмерных последовательностей гена с заменяющими мутациями, включая большое количество трансверсий и последующих заменяющих мутаций.

Приложения

SeSaM используется для прямой оптимизации белков на аминокислотном уровне, а также для предварительной идентификации аминокислотных положений для тестирования при насыщающем мутагенезе для идеального обмена аминокислот. SeSaM успешно применялся в многочисленных целенаправленных кампаниях по эволюции различных классов ферментов для их улучшения в отношении выбранных свойств, таких как целлюлаза для устойчивости к ионной жидкости,[11] протеаза с повышенной толерантностью к моющим средствам,[12] глюкозооксидаза для аналитического применения,[13] фитаза с повышенной термостабильностью [14] и монооксигеназа с улучшенной каталитической эффективностью с использованием альтернативных доноров электронов.[15] SeSaM защищен патентом US770374 B2 более чем в 13 странах и является одной из платформенных технологий SeSaM-Biotech GmbH.

Рекомендации

  1. ^ Вонг, Т.С.; Журина, Д .; Шванеберг, У. (2006). «Проблема разнообразия в направленной эволюции белка». Гребень. Chem. Экран с высокой пропускной способностью. 9 (4): 271–288. Дои:10.2174/138620706776843192. PMID  16724918.
  2. ^ Füllen, G .; Юван Д.К. (1994). «Генетические алгоритмы и рекурсивный ансамблевой мутагенез в белковой инженерии». Комплекс Int. 1.
  3. ^ Вонг, Т.С.; Roccatano, D .; Захария, М .; Шванеберг, У. (2006). «Статистический анализ методов случайного мутагенеза, используемых для направленной эволюции белка». J. Mol. Биол. 355 (4): 858–871. Дои:10.1016 / j.jmb.2005.10.082. PMID  16325201.
  4. ^ Вонг, Т.С.; Ти, К.Л .; Hauer, B .; Шванеберг, У. (2004). «Мутагенез с насыщением последовательностей (SeSaM): новый метод направленной эволюции белка». Нуклеиновые кислоты Res. 32 (3): e26. Дои:10.1093 / nar / gnh028. ЧВК  373423. PMID  14872057.
  5. ^ Вонг, Т.С.; Ти, К.Л .; Hauer, B .; Шванеберг, У. (2005). «Мутагенез с насыщением последовательности с настраиваемыми частотами мутаций». Анальный. Биохим. 341 (1): 187–189. Дои:10.1016 / j.ab.2005.03.023. PMID  15866543.
  6. ^ Вонг, Т.С.; Roccatano, D .; Loakes, D .; Ти, К.Л .; Schenk, A .; Hauer, B .; Шванеберг, У. (2008). «Мутагенез с насыщением последовательностей, обогащенных трансверсией (SeSaM-Tv +): метод случайного мутагенеза с последовательными заменами нуклеотидов, который дополняет предвзятость подверженной ошибкам ПЦР». Biotechnol. J. 3 (1): 74–82. Дои:10.1002 / biot.200700193. PMID  18022859.
  7. ^ d'Abbadie, M .; Hofreiter, M .; Вайсман, А .; Loakes, D .; Gasparutto, D .; Кадет, J .; Woodgate, R .; Pääbo, S .; Холлигер, П. (2007). «Молекулярное разведение полимераз для амплификации древней ДНК». Nat. Биотехнология. 25 (8): 939–943. Дои:10.1038 / nbt1321. ЧВК  1978225. PMID  17632524.
  8. ^ Mundhada, H .; Marienhagen, J .; Scacioc, A .; Schenk, A .; Roccatano, D .; Шванеберг, У. (2011). «SeSaM-Tv-II генерирует пространство белковых последовательностей, недоступное с помощью epPCR». ChemBioChem. 12 (10): 1595–1601. Дои:10.1002 / cbic.201100010. PMID  21671328.
  9. ^ Ruff, A.J .; Marienhagen, J .; Verma, R .; Roccatano, D .; Genieser, H.-G .; Niemann, R .; Shivange, A.V .; Шванеберг, У. (2012). «dRTP и dPTP - пара комплементарных нуклеотидов для метода мутагенеза с насыщением последовательностей (SeSaM)». J Mol Catal B-фермент. 84: 40–47. Дои:10.1016 / j.molcatb.2012.04.018.
  10. ^ Zhao, J .; Кардашлиев, Т .; Ruff, A.J .; Bocola, M .; Шванеберг, М. (2014). «Уроки разнообразия экспериментов направленной эволюции на основе анализа 3000 мутаций». Биотехнология Биоенг. 111 (2): 2380–2389. Дои:10.1002 / бит. 25302. PMID  24904008.
  11. ^ Pottkämper, J .; Barthen, P .; Ilmberger, N .; Schwaneberg, U .; Schenk, A .; Schulte, M .; Игнатьев, Н .; Streit, W. (2009). «Применение метагеномики для идентификации бактериальных целлюлаз, устойчивых в ионных жидкостях». Green Chem. 11 (7): 957–965. Дои:10.1039 / B820157A.
  12. ^ Ли, З .; Roccatano, D .; Lorenz, M .; Шванеберг, У. (2012). «Направленная эволюция субтилизина Е в высокоактивную протеазу, толерантную к хлориду гуанидиния и додецилсульфату натрия». ChemBioChem. 13 (5): 691–699. Дои:10.1002 / cbic.201100714. PMID  22408062.
  13. ^ Gutierrez, E.A .; Mundhada, H .; Meier, T .; Duefuel, H .; Bocola, M .; Шванеберг, У. (2013). «Реинжиниринг глюкозооксидазы для амперометрического определения глюкозы в аналитике диабета». Биосенс. Биоэлектрон. 50: 84–90. Дои:10.1016 / j.bios.2013.06.029. PMID  23835222.
  14. ^ Shivange, A.V .; Roccatano, D .; Шванеберг, У. (2016). «Итерационный опрос ключевых остатков фитазы с заменами, повышающими термостабильность, идентифицированными в направленной эволюции». Appl. Microbiol. Биот. 100 (1): 227–242. Дои:10.1007 / s00253-015-6959-5. PMID  26403922. S2CID  10424164.
  15. ^ Belsare, K.D .; Рог, Т .; Ruff, A.J .; Martinez, R .; Magnusson, A .; Holtmann, D .; Schrader, J .; Шванеберг, У. (2017). «Направленная эволюция P450cin для опосредованного переноса электронов». Prot. Англ. Des. Sel. 30 (2): 119–127. Дои:10.1093 / белок / gzw072. PMID  28007937.