Нормализация вестерн-блоттинга - Western blot normalization

Нормализация из Вестерн-блоттинг данные - это аналитический шаг, который выполняется для сравнения относительной численности определенного белок через полосы пятна или гель при различных экспериментальных методах лечения или в разных тканях или на стадиях развития.[1][2] Общая цель нормализации - минимизировать эффекты, возникающие из-за вариаций экспериментальных ошибок, таких как непоследовательная подготовка образца, неравномерная загрузка образца по полосам геля или неравномерный перенос белка, что может поставить под угрозу выводы, которые могут быть получены из Вестерн-блоттинг данные.[1] В настоящее время существует два метода нормализации Вестерн-блоттинг данные: (i) нормализация домашнего белка и (ii) нормализация общего белка.[1][2][3][4]

Процедура

Нормализация происходит непосредственно на геле или промокательной мембране. Сначала визуализируется окрашенный гель или блот, обводится прямоугольник вокруг целевого белка на каждой дорожке и измеряется интенсивность сигнала внутри прямоугольника.[1] Затем полученная интенсивность сигнала может быть нормализована относительно интенсивности сигнала внутреннего контроля загрузки, обнаруженного на том же геле или блоте.[1] При использовании белковых красителей мембрану можно инкубировать с выбранным красителем до или после иммунодетекции, в зависимости от типа окраски.[5]

Контроль содержания белка в домашних условиях

Гены домашнего хозяйства и белки, в том числе β-Актин, GAPDH, HPRT1, и RPLP1, часто используются в качестве внутреннего контроля в вестерн-блоты потому что считается, что они выражаются конститутивно на одних и тех же уровнях в разных экспериментах.[1][2][6][7] Однако недавние исследования показали, что экспрессия белков домашнего хозяйства (HKP) может изменяться в зависимости от типа клеток и биологических условий.[1][8][9][10] Поэтому научные издатели и финансирующие агентства теперь требуют, чтобы средства нормализации были предварительно проверены для каждого эксперимента, чтобы гарантировать воспроизводимость и точность результатов.[8][9][10]

Флуоресцентные антитела

При использовании флуоресцентных антител для визуализации белков в вестерн-блотах нормализация требует, чтобы пользователь определил верхний и нижний пределы количественного определения и охарактеризовал линейную зависимость между интенсивностью сигнала и массовым объемом образца для каждого антигена.[1] И целевой белок, и нормализационный контроль должны флуоресцировать в динамическом диапазоне обнаружения.[1] Многие HKP экспрессируются на высоком уровне и предпочтительны для использования с высокоэкспрессируемыми белками-мишенями.[1] Белки с низкой экспрессией трудно обнаружить на одном и том же блоте.[1]

Флуоресцентные антитела коммерчески доступны, и рекомендуется использовать полностью охарактеризованные антитела для обеспечения согласованности результатов.[11][12][13]

Когда флуоресцентное обнаружение не используется, белок контроля загрузки и интересующий белок должны значительно различаться по молекулярный вес поэтому они адекватно разделены гель-электрофорезом для точного анализа.[1]

Удаление мембраны

Мембраны необходимо удалить и повторно зондировать с помощью нового набора детектирующих антител при обнаружении нескольких белковых мишеней на одном и том же блоте.[6] Неэффективное удаление может привести к слабому сигналу от целевого белка.[6] Чтобы предотвратить потерю антигена, рекомендуется проводить только три инкубации со стриппингом на мембрану.[6] Может быть трудно полностью исключить сигнал от белков с высоким содержанием белка, поэтому рекомендуется сначала обнаруживать белки с низкой экспрессией.[6]

Экзогенные всплески контроля

Поскольку уровни HKP могут быть разными в разных тканях, ученые могут контролировать интересующий белок, добавляя чистый, экзогенный белок известной концентрации в линейном диапазоне антитела.[8][9][10] По сравнению с HKP, для контрольных добавок доступен более широкий спектр белков.[14]

Нормализация общего белка

При нормализации общего белка (TPN) содержание целевого белка нормализуется к общему количеству белка на каждой дорожке.[3][4] Поскольку TPN не зависит от одного элемента управления загрузкой, проверка элементов управления и снятие / повторное зондирование блотов для обнаружения HKP не требуется.[6][15] Это может улучшить точность (до 0,1 мкг общего белка на дорожку), рентабельность и надежность данных.[16]

Флуоресцентные пятна и гели без пятен требуют специального оборудования для визуализации белков на геле / ​​пятнах.[5] Пятна могут не покрывать пятно равномерно; К краям пятна может скапливаться больше пятен, чем в центре. Неравномерность изображения может привести к неточной нормализации.[1]

Пятна до антител

Анионные красители, такие как Понсо С и Кумасси бриллиантовый синий и флуоресцентные красители, такие как Sypro Ruby и Deep Purple, используются до добавления антител, потому что они не влияют на последующее имумуноопределение.[17][18][19][20]

Ponceau S - отрицательно заряженный обратимый краситель, окрашивающий белки в красновато-розовый цвет и легко удаляемый при промывании водой.[21][22] Интенсивность окрашивания Ponceau S быстро уменьшается со временем, поэтому документацию следует проводить быстро.[5] Сообщается о линейном диапазоне до 140 мкг для Ponceau S с плохой воспроизводимостью из-за его сильно зависящей от времени интенсивности окрашивания и низкого отношения сигнал / шум.[21][22]

Флуоресцентные красители, такие как Sypro Ruby, имеют широкий линейный диапазон и более чувствительны, чем анионные красители.[22] Это стойкие светостойкие пятна, которые можно визуализировать с помощью стандартного трансиллюминатора ультрафиолетового или синего света или лазерного сканирования.[1][22] Затем мембраны можно задокументировать на пленке или в цифровом виде с помощью CCD камера.[23] Окрашивание Sypro Ruby blot требует много времени и, как правило, насыщает более 50 мкг белка на дорожку.[22]

Пост-антитела пятна

Амидо черный представляет собой обычно используемую стойкую анионную окраску пост-антител, которая более чувствительна, чем Ponceau S.[24] Это пятно наносится после имумунодетекции.[24]

Технология без пятен

В технологии без образования пятен для визуализации используется химия в геле.[22][25][26] Эта химическая реакция не влияет на перенос белка или последующее связывание антител.[27] Кроме того, он не включает этапов окрашивания / обесцвечивания, а интенсивность полос остается постоянной во времени.[28]

Технология без пятен не позволяет обнаруживать белки, не содержащие триптофан остатки. Для обнаружения необходимо как минимум два триптофана.[5] Линейный диапазон для нормализации без пятен составляет до 80 мкг белка на дорожку для 18-луночных гелей и до 100 мкг на дорожку для 12-луночных гелей среднего размера Criterion. Этот диапазон совместим с типичными загрузками белка в количественном вестерн-блоттинге и позволяет рассчитывать контроль загрузки в широком диапазоне загрузки белка.[29][4] Недавно стал доступен более эффективный метод удаления пятен.[30][31] При использовании большого количества белка технология очистки от пятен продемонстрировала больший успех, чем пятна.[29]

Рекомендации

  1. ^ а б c d е ж грамм час я j k л м п Тейлор, Южная Каролина; Беркельман, Т; Ядав, G; Хаммонд, М. (2016-08-23). «Определенная методология надежной количественной оценки данных вестерн-блоттинга». Мол. Биотехнология. 55 (3): 217–26. Дои:10.1007 / s12033-013-9672-6. ЧВК  3840294. PMID  23709336.
  2. ^ а б c Thellin, O .; Zorzi, W .; Lakaye, B .; Де Борман, В .; Coumans, B .; Hennen, G .; Grisar, T .; Игоут, А .; Хайнен, Э. (1999-10-08). «Гены домашнего хозяйства как внутренние стандарты: использование и ограничения». Журнал биотехнологии. 75 (2–3): 291–295. Дои:10.1016 / s0168-1656 (99) 00163-7. ISSN  0168-1656. PMID  10617337.
  3. ^ а б Олдридж, Джорджина М .; Подребарак, Дэвид М .; Гриноу, Уильям Т .; Вейлер, Иван Жанна (30.07.2008). «Использование окрашивания общего белка в качестве контроля загрузки: альтернатива высокопродуктивному контролю с одним белком в полуколичественном иммуноблоттинге». Журнал методов неврологии. 172 (2): 250–254. Дои:10.1016 / j.jneumeth.2008.05.003. ЧВК  2567873. PMID  18571732.
  4. ^ а б c Collins, Mahlon A .; An, Jiyan; Пеллер, Даниэль; Баузер, Роберт (2015-08-15). «Общий белок - эффективный контроль нагрузки для вестерн-блоттинга спинномозговой жидкости». Журнал методов неврологии. 251: 72–82. Дои:10.1016 / j.jneumeth.2015.05.011. ЧВК  4540354. PMID  26004848.
  5. ^ а б c d "Нормализация общего белка для вестерн-блоттинга - Advansta Inc.". 2014-11-05. Получено 2016-10-01.
  6. ^ а б c d е ж Bass, J. J .; Уилкинсон, Д. Дж .; Ранкин, Д .; Phillips, B.E .; Szewczyk, N.J .; Smith, K .; Атертон, П. Дж. (05.06.2016). «Обзор технических аспектов применения Вестерн-блоттинга в физиологических исследованиях». Скандинавский журнал медицины и науки о спорте. 27 (1): 4–25. Дои:10.1111 / смс.12702. ISSN  1600-0838. ЧВК  5138151. PMID  27263489.
  7. ^ Ли, Рена; Шен, Юн (2013-04-19). «Старый метод сталкивается с новой проблемой: повторное использование домашних белков в качестве внутреннего контрольного контроля для исследований в области нейробиологии». Науки о жизни. 92 (13): 747–751. Дои:10.1016 / j.lfs.2013.02.014. ISSN  1879-0631. ЧВК  3614345. PMID  23454168.
  8. ^ а б c Чжу, Цзян; Он, Фухонг; Песня, Шухуэй; Ван, Цзин; Ю, июн (01.01.2008). «Сколько человеческих генов можно определить как хозяйственные с текущими данными по экспрессии?». BMC Genomics. 9: 172. Дои:10.1186/1471-2164-9-172. ISSN  1471-2164. ЧВК  2396180. PMID  18416810.
  9. ^ а б c Барбер, Роберт Д.; Хармер, Дэн В .; Коулман, Роберт А .; Кларк, Брайан Дж. (11 мая 2005 г.). «GAPDH как ген домашнего хозяйства: анализ экспрессии мРНК GAPDH на панели из 72 тканей человека». Физиологическая геномика. 21 (3): 389–395. CiteSeerX  10.1.1.459.7039. Дои:10.1152 / физиолгеномика.00025.2005. ISSN  1094-8341. PMID  15769908.
  10. ^ а б c Ли, Питер Д .; Сладек, Роберт; Гринвуд, Селия М. Т .; Хадсон, Томас Дж. (01.02.2002). «Контрольные гены и изменчивость: отсутствие повсеместных справочных транскриптов в разнообразных исследованиях экспрессии млекопитающих». Геномные исследования. 12 (2): 292–297. Дои:10.1101 / гр.217802. ISSN  1088-9051. ЧВК  155273. PMID  11827948.
  11. ^ Каучман, Джон Р. (2016-10-01). «Коммерческие антитела: хорошее, плохое и действительно уродливое». Журнал гистохимии и цитохимии. 57 (1): 7–8. Дои:10.1369 / jhc.2008.952820. ISSN  0022-1554. ЧВК  2605718. PMID  18854593.
  12. ^ Gilda, Jennifer E .; Гош, Раджешвари; Cheah, Jenice X .; West, Toni M .; Bodine, Sue C .; Гомес, Олдрин В. (2015-08-19). «Неточности вестерн-блоттинга с непроверенными антителами: необходимость в минимальном стандарте отчетности для вестерн-блоттинга (WBMRS)». PLoS ONE. 10 (8): e0135392. Дои:10.1371 / journal.pone.0135392. ISSN  1932-6203. ЧВК  4545415. PMID  26287535.
  13. ^ «Проверка антител: насущная необходимость | The Scientist Magazine®». Ученый. Получено 2016-10-01.
  14. ^ «6 изменений, которые существенно повлияют на вашу последовательность РНК; Часть 3 - Геномика кофакторов». cofactorgenomics.com. Получено 2016-10-01.
  15. ^ Фосанг, Аманда Дж .; Колбран, Роджер Дж. (11 декабря 2015 г.). «Прозрачность - ключ к качеству». Журнал биологической химии. 290 (50): 29692–29694. Дои:10.1074 / jbc.E115.000002. ISSN  0021-9258. ЧВК  4705984. PMID  26657753.
  16. ^ Мориц, CP. (2017-09-20). «Тубулин или не тубулин: переход к общему окрашиванию белка в качестве контроля нагрузки при вестерн-блоттинге» (PDF). Протеомика. 17 (20): 1600189. Дои:10.1002 / pmic.201600189. PMID  28941183.
  17. ^ Велиндер, Шарлотта; Экблад, Ларс (04.03.2011). «Окрашивание Кумасси как контроль нагрузки в Вестерн-блоттинге». Журнал протеомных исследований. 10 (3): 1416–1419. Дои:10.1021 / pr1011476. ISSN  1535-3893. PMID  21186791.
  18. ^ Ранганатан, Велвижи; Де, Прабир К. (1996-02-01). «Вестерн-блоттинг белков из полиакриламидных гелей, окрашенных кумасси». Аналитическая биохимия. 234 (1): 102–104. Дои:10.1006 / abio.1996.0057. PMID  8742090.
  19. ^ Штейнбергер, Б. (01.05.2015). «Оценка окрашивания общего белка SYPRO Ruby для нормализации двумерных вестерн-блотов». Аналитическая биохимия. 476 (1): 17–19. Дои:10.1016 / j.ab.2015.01.015. PMID  25640586.
  20. ^ "Нормализация общего белка для вестерн-блоттинга - Advansta Inc.". Получено 2016-10-01.
  21. ^ а б Rivero-Gutiérrez, B .; Anzola, A .; Martínez-Augustin, O .; де Медина, Ф. Санчес (2014-12-15). «Обнаружение без красителей в качестве контроля загрузки, альтернатива Ponceau и иммунодетекция белков домашнего хозяйства с помощью вестерн-блоттинга». Аналитическая биохимия. 467: 1–3. Дои:10.1016 / j.ab.2014.08.027. ISSN  1096-0309. PMID  25193447.
  22. ^ а б c d е ж Гюртлер, Анна; Кунц, Нэнси; Гомолка Мария; Хорнхардт, Сабина; Фридл, Анна А .; Макдональд, Кевин; Кон, Джонатан Э .; Пощ, Антон (15.02.2013). «Технология без пятен как инструмент нормализации в Вестерн-блоттинге». Аналитическая биохимия. 433 (2): 105–111. Дои:10.1016 / j.ab.2012.10.010. PMID  23085117.
  23. ^ «Флуоресцентная визуализация: принципы и методы» (PDF). Получено 10 января 2018.
  24. ^ а б Гольдман, А; Харпер, S; Speicher, DW (01.11.2016). Обнаружение белков на блот-мембранах. Текущие протоколы в науке о белке. 86. С. 10.8.1–10.8.11. Дои:10.1002 / cpps.15. ISBN  9780471140863. ЧВК  5646381. PMID  27801518.
  25. ^ Цайтлер, Анна Ф .; Геррер, Катрин Х .; Хаас, Райнер; Хименес-Сото, Луиза Ф. (01.07.2016). «Оптимизированный полуколичественный блот-анализ в анализах на инфекцию с использованием технологии Stain-Free». Журнал микробиологических методов. 126: 38–41. Дои:10.1016 / j.mimet.2016.04.016. PMID  27150675.
  26. ^ "Бесконтактная технология | Приложения и технологии | Bio-Rad". www.bio-rad.com. Получено 2016-10-01.
  27. ^ Колелла, Алекс Д .; Чегении, Нуша; Чай, Мелинда Н .; Гиббинс, Ян Л .; Уильямс, Керин А.; Чатавей, Тим К. (15 ноября 2012 г.). «Сравнение гелей без пятен с традиционной методологией контроля нагрузки иммуноблоттинга». Аналитическая биохимия. 430 (2): 108–110. Дои:10.1016 / j.ab.2012.08.015. PMID  22929699.
  28. ^ Gilda, Jennifer E .; Гомес, Олдрин В. (15.09.2013). «Окрашивание общего белка без красителей является лучшим контролем нагрузки по сравнению с β-актином для вестерн-блоттинга». Аналитическая биохимия. 440 (2): 186–188. Дои:10.1016 / j.ab.2013.05.027. ЧВК  3809032. PMID  23747530.
  29. ^ а б Симони, К. и Ядав, Г. (7 августа 2016 г.). «Тенденции в количественном вестерн-блоттинге - появление нормализации общего белка». Биологические технологии. Advantage Media.
  30. ^ "Подход к вестерн-блоттингу без окрашивания | Статьи журнала GEN | GEN". GEN. Получено 2016-10-01.
  31. ^ Gilda, JenniferE .; Gomes, AldrinV. (01.01.2015). Пош, Антон (ред.). Протеомное профилирование. Методы молекулярной биологии. 1295. Springer Нью-Йорк. С. 381–391. Дои:10.1007/978-1-4939-2550-6_27. ISBN  9781493925490. PMID  25820735.

внешняя ссылка