Щелочной лизис - Alkaline lysis

Щелочной лизис или же щелочная экстракция это метод, используемый в молекулярная биология к выделить плазмидную ДНК от бактерий.

Метод

Бактерии, содержащие плазмида представляют интерес в первую очередь культурный, то образец центрифугированный с целью концентрирования клеточного материала (в том числе ДНК ) в таблетку на дне емкости. Супернатант отбрасывают, а затем осадок повторно суспендируют в EDTA -содержащие физиологические буфер. Целью EDTA является хелатирование катионов двухвалентных металлов, таких как Mg2+ и Ca2+, которые необходимы для функционирования ферментов, разрушающих ДНК (ДНКазы ), а также служат для дестабилизации фосфатного остова ДНК и клеточной стенки. Глюкоза в буфере будет поддерживать осмотическое давление клетки, чтобы предотвратить разрыв клетки. Трис в буфере сохранит pH клетки до 8,0, а РНКаза удалит РНК, что нарушит эксперимент.

Отдельно сильный щелочной раствор, состоящий из моющего средства додецилсульфат натрия (SDS) и прочная база, такая как едкий натр (NaOH) готовят и затем добавляют. Полученную смесь инкубируют несколько минут. За это время моющее средство разрушает клеточные мембраны и позволяет щелочи контактировать с ними и денатурировать их. хромосомный и плазмидная ДНК. После разрыва клеточной мембраны с помощью SDS содержимое клетки нейтрализует NaOH; поэтому pH лизиса снижается с 12,8 до 12,3. Таким образом, если бактериальных клеток недостаточно, дополнительный NaOH будет генерировать небольшие фрагменты ДНК. Но 0,5 M L-аргинин, который может обеспечить стабильный pH, можно использовать для замены 0,1 M гидроксида натрия.[1]

Ну наконец то, ацетат калия добавлен. Это подкисляет раствор и позволяет ренатурировать плазмидную ДНК, но не хромосомную ДНК, которая осаждается из раствора. Другая функция калия - вызывать осаждение додецилсульфат натрия и, таким образом, удаление моющего средства. Выполняется заключительное центрифугирование, и на этот раз осадок содержит только мусор, и его можно выбросить. Супернатант, содержащий плазмиду, осторожно удаляется и может быть дополнительно очищен или использован для анализа, например гель-электрофорез.

Другое использование

Кроме того, щелочной лизис иногда используется для извлечения генетического материала растений. Клетки растений подвергаются воздействию сильнощелочного раствора, содержащего детергент (обычно цвиттерионный или же неионогенный моющее средство Такие как Подросток 20 ), и смесь инкубируют при высокой температуре. Этот метод используется не так часто из-за способности гидроксида натрия повреждать генетический материал, уменьшая размер фрагментов ДНК.

Рекомендации

  1. ^ {Cloninger, 2008 № 100}
  • Щелочной лизис на молекулярной кухне Мама Джи
  • Birnboim HC, Doly J (ноябрь 1979 г.). «Процедура быстрой щелочной экстракции для скрининга рекомбинантной плазмидной ДНК». Нуклеиновые кислоты Res. 7 (6): 1513–23. Дои:10.1093 / nar / 7.6.1513. ЧВК  342324. PMID  388356.