Плазмидный препарат - Plasmid preparation
 | Эта статья нужны дополнительные цитаты для проверка. (Февраль 2018 г.) (Узнайте, как и когда удалить этот шаблон сообщения) |
А препарат плазмиды это метод Извлечение ДНК и очистка для плазмидная ДНК. Было разработано множество методов очистки плазмид. ДНК из бактерии. Эти методы неизменно включают три этапа:[1]
- Рост бактериальной культуры
- Сбор урожая и лизис бактерий
- Очистка плазмидной ДНК
Рост бактериальной культуры
Плазмиды почти всегда очищены от жидкости культуры бактерий, обычно Кишечная палочка, которые были преобразованный и изолированы. Практически все широко используемые плазмидные векторы кодируют один или несколько устойчивость к антибиотикам гены как выбираемый маркер например, ген, кодирующий устойчивость к ампициллину или канамицину, который позволяет бактериям, которые были успешно трансформированы, размножаться без подавления. Предполагается, что бактерии, которые не захватили плазмидный вектор, лишены гена устойчивости, и поэтому ожидается, что будут расти только колонии, представляющие успешные трансформации. Бактерии выращивают в благоприятных условиях.
Сбор и лизис бактерий
Когда бактерии лизируются под щелочной условиях (pH 12,0–12,5) как хромосомной ДНК, так и белок денатурированы; однако плазмидная ДНК остается стабильной. Некоторые ученые снижают концентрацию используемого NaOH до 0,1 М, чтобы уменьшить возникновение оцДНК. После добавления ацетат -содержащая нейтрализация буфер большой и меньший суперскрученный хромосомный ДНК и белки осаждаются, но маленькие плазмиды бактериальной ДНК остаются в растворе.
Препараты по размеру
Наборы для очистки плазмидной ДНК доступны от различных производителей, названные по размеру бактериальной культуры и соответствующему выходу плазмид. В порядке возрастания это минипреп, мидипреп, максипреп, мегапреп и гигапреп. Выход плазмидной ДНК будет варьироваться в зависимости от количества копий плазмиды, типа и размера, бактериального штамма, условий роста и набора.
Минипрепарат
Минипрепарат плазмидной ДНК - это быстрое и мелкомасштабное выделение плазмида ДНК из бактерии. Он основан на щелочной лизис метод. Извлеченная плазмидная ДНК, полученная в результате выполнения минипрепарата, сама по себе часто называется «минипреп». Минипрепараты используются в процессе молекулярное клонирование анализировать бактериальный клоны. Типичный выход плазмидной ДНК минипрепарата составляет от 5 до 50 мкг в зависимости от клеточного штамма. Минирепрепление большого количества плазмид также может быть удобно выполнено на фильтровальной бумаге путем лизирования клетки и элюирования плазмиды на фильтровальной бумаге.
Midipreparation
Начальный объем культуры E. coli составляет 15-25 мл. Бульон лизогении (LB) и ожидаемый выход ДНК составляет 100-350 мкг.
Максипрепарат
Начальный объем культуры E. coli составляет 100-200 мл LB, а ожидаемый выход ДНК составляет 500-850 мкг.
Мегапрепарат
Начальный объем культуры E. coli составляет 500 мл - 2,5 л LB, а ожидаемый выход ДНК составляет 1,5-2,5 мг.
Гигапрепарат
Начальный объем культуры E. coli составляет 2,5–5 л LB, а ожидаемый выход ДНК составляет 7,5–10 мг.
Очистка плазмидной ДНК
Существует множество методов очистки нуклеиновых кислот. Все работают по принципу создания условий, при которых осаждается либо только нуклеиновая кислота, либо только другие. биомолекулы осадок, позволяющий отделить нуклеиновую кислоту.
Осаждение этанолом
Осаждение этанолом работает с использованием этиловый спирт как антирастворитель ДНК, заставляя его выпадать в осадок из раствора. Растворимая фракция выбрасывается для удаления других биомолекул.
Колонка вращения
Очистка нуклеиновых кислот на спин-колонке осаждает нуклеиновую кислоту, так что она связывает твердую матрицу, и через нее протекают другие компоненты. Затем условия меняют для элюирования очищенной нуклеиновой кислоты.
Фенол-хлороформная экстракция
В фенол-хлороформная экстракция, добавление фенол /хлороформ смесь растворяет белковые и липидные примеси, оставляя нуклеиновые кислоты в водной фазе. Он также денатурирует белки, например ДНКаза, что особенно важно, если плазмиды будут использоваться для фермент пищеварение. В противном случае может возникнуть смазывание в форме плазмидной ДНК с ограниченным ферментом.
Рекомендации
- ^ Бушар, Ролан; и другие. (2010). Лабораторные методы в микробиологии. Универсальный научный. С. 119–126.
дальнейшее чтение
- Birnboim HC, Doly J (ноябрь 1979 г.). «Процедура быстрой щелочной экстракции для скрининга рекомбинантной плазмидной ДНК». Исследования нуклеиновых кислот. 7 (6): 1513–23. Дои:10.1093 / nar / 7.6.1513. ЧВК 342324. PMID 388356.