Delitto perfetto - Delitto perfetto

Delitto perfetto (Итальянский:[deˈlitto perˈfɛtto]) является генетическим методом для in vivo сайт-направленный мутагенез в дрожжах. Это название по-итальянски означает «совершенное убийство», и оно относится к способности техники создавать желаемые генетические изменения, не оставляя чужеродной ДНК в организме. геном.

Фон

Этот метод был разработан группой в Национальный институт наук об окружающей среде (NIEHS) в составе Майкла А. Резника, Франчески Сторичи (ныне в Технологическом институте Джорджии) и Л. Кевина Льюиса (ныне в Юго-Западном Техасском государственном университете). В методе используются синтетические олигонуклеотиды в сочетании с клеточным процессом гомологичная рекомбинация. Следовательно, он хорошо подходит для генетических манипуляций с дрожжами, которые имеют высокоэффективную гомологичную рекомбинацию. В delitto perfetto подход был использован для получения единичных и множественных точечных мутаций, усечений или вставок генов, а также делеций целых генов (включая основные гены).

Преимущества

Основным преимуществом этого метода является его способность удалять любую чужеродную ДНК из генома после процесса мутагенеза. Это гарантирует отсутствие выбираемые маркеры или экзогенные последовательности, используемые для нацеливания, остаются в геноме, что может вызвать непредвиденные эффекты.

В delitto perfetto метод также проще по сравнению с другими методами для in vivo сайт-направленный мутагенез. Другие методы требуют нескольких шагов клонирования и обширных Секвенирование ДНК для подтверждения мутагенеза, который часто является сложным и неэффективным процессом.[1][2][3]

Этот подход отличается большой гибкостью, поскольку после вставки кассеты CORE (подробности см. В Обзоре метода) можно легко и быстро произвести множественные мутации в интересующем гене.

Этот метод может быть применен к другим организмам, у которых эффективна гомологичная рекомбинация, таким как мох. Physcomitrella patens, Куриные клетки DT40, или Кишечная палочка. Кроме того, можно изучать гены человека и аналогичным образом генетически модифицированный в дрожжах с помощью искусственные хромосомы дрожжей (YAC).

Недостатки

Поскольку delitto perfetto Методика основана на гомологичной рекомбинации, этот процесс должен функционировать в клетках, чтобы метод работал. В Saccharomyces cerevisiae, то RAD52 ген необходим для гомологичной рекомбинации и, следовательно, необходим для delitto perfetto метод.

Этот метод полезен только для приложений, в которых нет необходимости в выбираемых маркерах. Например, мутагенизированные штаммы дрожжей нельзя использовать для дальнейшего генетического анализа, такого как тетрадный анализ. Маркеры должны быть вставлены в соответствующий локус в отдельном процессе.

Технические недостатки

  • Стоимость олигонуклеотидов
  • Мутагенез ограничен областью генома, окружающей вставленную кассету.
  • Ограниченное количество репортерные гены (ограничено доступными кассетами CORE)
  • Низкая эффективность для определенных приложений (например, удаление важных генов)

Обзор метода

Delitto Perfetto это двухэтапный метод для in vivo мутагенез. На начальном этапе кассета CORE вставляется в интересующую область путем гомологичной рекомбинации. Затем кассета CORE заменяется ДНК, содержащей интересующую мутацию.

Рисунок 1. Кассеты CORE для Delitto Perfetto

Кассеты CORE

Кассета CORE содержит как COнеобратимый маркер и REген портера. Репортерный ген позволяет отобрать дрожжевые клетки, которые получают кассету CORE на первом этапе процесса. Контрселективный маркер позволяет отобрать дрожжевые клетки, которые теряют кассету CORE, путем интеграции мутантного олигонуклеотида во время второй стадии процесса.

На выбор предлагается множество кассет CORE, которые содержат множество репортерных генов, контрселективных производителей и дополнительные функции.[4]

Репортерные гены

  • kanMX4 - позволяет выращивать в средах, содержащих Генетицин
  • hyg - позволяет выращивать в средах, содержащих Гигромицин B.

Маркеры с возможностью выбора

  • KlURA3 - предотвращает рост в средах, содержащих 5-фтороротовую кислоту.
  • GAL1 / 10-p53 - предотвращает рост в средах, содержащих галактоза. Он кодирует токсичный мутант p53 под GAL1 промоутер.[5]

Дополнительные возможности

  • GAL1-Я-СценаI - Повышает эффективность нацеливания на хромосому, содержащую кассету CORE, в диплоидных клетках. Он содержит эндонуклеаза рестрикции SceI под GAL1 промотор и целевая последовательность SceI.[6][7]
фигура 2. ОбзорDelitto Perfetto для удаления гена

Техника рабочего процесса

Сначала кассета CORE усиливается ПЦР с праймерами, содержащими области, гомологичные хромосомному участку, в который он будет вставлен. Кассета CORE интегрируется посредством гомологичной рекомбинации. Клетки, содержащие кассету CORE, могут быть отобраны для использования репортерного гена и могут быть дополнительно подтверждены с использованием контрселективного маркера. Интеграция кассеты CORE в правильном хромосомном положении может быть проверена с помощью ПЦР с использованием праймеров, которые отжигаются перед сайтом интеграции, внутри CORE и ниже размера интеграции, которые предназначены для генерации фрагментов размером 500-1500 п.н.[4]

CORE-содержащие дрожжевые клетки трансформируют олигонуклеотидами, содержащими желаемую мутацию, так что они приводят к потере кассеты CORE во время гомологичной рекомбинации. Трансформанты отбираются с использованием контрселективного маркера и могут быть дополнительно подвергнуты скринингу с использованием репортерного гена. Секвенирование используется для гарантии того, что правильная мутация была произведена без дополнительных мутаций. В качестве альтернативы, если мутация приводит к образованию или потере сайта рестрикции, ПЦР с последующим рестрикционным гидролизом может использоваться для подтверждения того, что желаемая мутация интегрирована.[4]

Двухцепочечный разрыв (DSB) опосредован delitto perfetto

Чтобы увеличить нацеливание олигонуклеотидов на кассету CORE, кассеты CORE, содержащие GAL1-Я-СценаЯ могу использовать функцию. Эта функция позволяет экспрессировать SceI, эндонуклеазу, которая распознает уникальную 18 нуклеотидную последовательность, которая вряд ли встретится где-либо еще в С. cerevisiae геном. Эндонуклеаза SceI способна генерировать DSB на сайте SceI, что приводит к привлечению Ремонт ДНК машины.[8] Это увеличивает частоту целевой гомологичной рекомбинации в 4000 раз по сравнению с тем, когда DSB не генерируется.[6]

Общие соображения по дизайну олигонуклеотидов

Олигонуклеотиды размером 80–100 п.н. могут быть получены в виде отдельных молекул или пар олигонуклеотидов, которые полностью или частично перекрываются. Тип рекомендованного олигонуклеотида зависит от типа мутации и расстояния от сайта интеграции кассеты CORE, на котором желательна мутация.

Более длинные олигонуклеотиды приводят к повышению эффективности трансформации. Полностью комплементарные пары олигонуклеотидов приводят к 5–10-кратному увеличению эффективности по сравнению с отдельными олигонуклеотидами и рекомендуются для всех применений.[4][9] Однако они обеспечивают небольшое окно мутагенеза всего в 20-40 оснований из кассеты CORE. Чтобы увеличить окно мутагенеза, можно использовать пары олигонуклеотидов с перекрытием в 20 п.н., что позволяет нацеливать до 100 п.н. выше и ниже сайта интеграции CORE. Однако они трансформируются примерно в 6 раз менее эффективно. Для повышения эффективности частично перекрывающиеся олигонуклеотиды могут быть расширены. in vitro.[9]

Для делеций генов

Конструируют олигонуклеотиды, содержащие последовательность, расположенную выше, сразу за которой следует последовательность, расположенная ниже области, которая должна быть выбита. В случае делеций генов пары полностью перекрывающихся олигонуклеотидов размером 80–100 п.н. приводят к 5–10-кратному увеличению эффективности трансформации, чем одиночные олигонуклеотиды.[4]

Для точечных мутаций

Для мутаций от 20 до 40 п.н. из кассеты CORE рекомендуется 80-100 п.н. полностью перекрывающихся олигонуклеотидов. Для мутаций более 40 п.н. из кассеты CORE необходимо использовать частично перекрывающиеся олигонуклеотиды. Для повышения их эффективности трансформации рекомендуется удлинить частично перекрывающиеся олигонуклеотиды. in vitro.[4][6][9]

Для основных генов

Для создания мутантов основных генов кассета CORE может быть вставлена ​​ниже интересующего гена, однако это ограничивает области гена, доступные для мутации. В качестве альтернативы можно использовать диплоидные клетки. Однако использование диплоида снижает эффективность нацеливания олигонуклеотидов из-за присутствия двух подходящих хромосомных участков для рекомбинации олигонуклеотидов. Чтобы устранить этот недостаток, можно использовать метод delitto perfetto, опосредованный DSB. Это увеличивает частоту целевой гомологичной рекомбинации в 700 раз по сравнению с тем, когда DSB не генерируется. Более того, он в 2–5 раз эффективнее других доступных методов.[6][9]

Частота фоновых мутаций

Сообщается, что, когда не образуются двухцепочечные разрывы, количество клеток, которые теряют кассету CORE в отсутствие нацеливающего олигонуклеотида, составляет менее одного трансформанта на 107 жизнеспособные клетки. Напротив, это число увеличивается до 100 трансформантов на 107 жизнеспособные клетки, когда образуется двухцепочечный разрыв. В диплоиде повышенная частота фоновых мутаций происходит из-за гомологичной рекомбинации с гомологичной хромосомой, что снижает количество целевых трансформаций до 4% от общего числа трансформантов.[6]

Рекомендации

  1. ^ Эрдениз Н., Мортенсен У., Ротштейн Р. (1997) Методы замены аллелей на основе ПЦР без клонирования. Genome Res. 7: 1174-83.
  2. ^ Langle-Rouault F., Jacobs E. (1995) Метод выполнения точных изменений в геноме дрожжей с использованием пригодного для повторного использования селектируемого маркера. Nucleic Acids Res. 23: 3079-81.
  3. ^ Шерер С., Дэвис Р.В. (1979) Построенная замена сегментов хромосомы измененными последовательностями ДНК. in vitro. Proc Natl Acad Sci. 76: 4951-5.
  4. ^ а б c d е ж Сторичи Ф., Резник М.А. (2006) Подход delitto perfetto к in vivo сайт-направленный мутагенез и хромосомные перестройки с синтетическими олигонуклеотидами в дрожжах. Методы Энзимол. 409: 329-45.
  5. ^ Инга А., Резник М.А. (2001) Новые мутации человеческого р53, токсичные для дрожжей, могут усиливать трансактивацию специфических промоторов и мутантов реактивного опухолевого р53. Онкоген. 14; 20 (27): 3573-9
  6. ^ а б c d е Сторичи Ф., Дарем ЦЛ., Горденин Д.А., Резник М.А. (2003) Хромосомные сайт-специфичные двухцепочечные разрывы эффективно нацелены на репарацию олигонуклеотидами в дрожжах. Proc Natl Acad Sci. 9; 100 (25): 14994-9
  7. ^ Plessis A., Perrin A., Haber JE., Dujon B. (1992) Сайт-специфическая рекомбинация, определяемая I-SceI, митохондриальной эндонуклеазой группы I, кодируемой интроном, экспрессируемой в ядре дрожжей. Генетика. 130 (3): 451-60
  8. ^ Сторичи Ф., Резник М.А. (2003) Delitto perfetto направленный мутагенез в дрожжах с использованием олигонуклеотидов. Genet Eng. 25: 189-207
  9. ^ а б c d Сторичи Ф., Льюис Л.К., Резник М.А. (2001) Сайт-направленный мутагенез in vivo с использованием олигонуклеотидов. Nat Biotechnol. 19 (8): 773-6