Flow-FISH - Википедия - Flow-FISH

Flow-FISH (флуоресцентная гибридизация in situ) представляет собой цитогенетический метод количественной оценки количества копий конкретных повторяющихся элементов в геномной ДНК целых популяций клеток за счет комбинации проточной цитометрии с цитогенетическим флуоресцентная гибридизация in situ протоколы окрашивания.[1] Flow-FISH чаще всего используется для количественной оценки длины теломеры, которые являются отрезками повторяющихся ДНК (гексамерные TTAGGG-повторы) на дистальных концах хромосомы[2] в человеческом белые кровяные клетки, и полуавтоматический метод для этого был опубликован в Nature Protocols.[1] Теломер длина в белые кровяные клетки был предметом интереса, потому что длина теломер в этих типах клеток (а также других соматический тканей) постепенно снижается в течение продолжительности жизни человека, в результате чего клетки старение, апоптоз,[3] или же трансформация.[4] Было показано, что это снижение является суррогатным маркером сопутствующего уменьшения длины теломер пула гематопоэтических стволовых клеток, причем линия гранулоцитов дает лучшее указание, предположительно из-за отсутствия подтипа долгоживущей памяти и сравнительно быстрого обмена эти клетки.[5]

Q-FISH в Flow-FISH

Flow-FISH был впервые опубликован в 1998 году Rufer et al.[6] как модификация другого метода анализа длины теломер, Q-FISH, который нанимает пептидная нуклеиновая кислота зонды[7] последовательности 3'-CCCTAACCCTAACCCTAA-5 ', меченной флуоресцин флуорофор окрашивать теломерные повторы на подготовленных метафаза распространение клеток, обработанных колцемид, гипотонический шок и фиксация скользить через метанол /уксусная кислота лечение[8] Изображения образовавшихся флуоресцентных пятен можно затем проанализировать с помощью специализированной компьютерной программы, чтобы получить количественные значения флуоресценции, которые затем можно использовать для оценки фактической длины теломер. Флуоресценция, полученная при окрашивании зонда, считается количественной, поскольку PNA связывается преимущественно с ДНК при низких концентрациях ионной соли и в присутствии формамид, таким образом, дуплекс ДНК не может преобразоваться после того, как он был расплавлен и отожжен до PNA зонд, позволяя зонду насыщать свою последовательность повторения-мишени (поскольку он не вытесняется из ДНК-мишени конкурирующей антисмысловой ДНК на комплементарной цепи), таким образом обеспечивая надежное и поддающееся количественному измерению считывание частоты PNA мишень зонда на данном участке хромосомы после смывания несвязанного зонда.[8]

ДНК денатурируется путем нагревания и обработки формамидом, зонду PNA дают возможность гибридизоваться, избыток зонда смывают, считывание проводят в проточном цитометре.

Инновации

В отличие от Q-FISH, Flow-FISH использует количественные свойства специфичных для теломер. PNA удерживание зонда для количественной оценки средней флуоресценции в численность населения ячеек, за счет использования проточный цитометр, вместо флуоресцентного микроскопа.[9] Основным преимуществом этого метода является то, что он устраняет время, необходимое в Q-FISH для подготовки метафазных распределений представляющих интерес клеток, и что проточно-цитометрический анализ также значительно быстрее, чем методы, необходимые для получения и анализа слайдов, подготовленных Q-FISH. Таким образом, Flow-FISH позволяет проводить высокопроизводительный анализ длины теломер в лейкоцитах крови, которые являются легкодоступной формой образца ткани человека. Самые последние версии метода flow-FISH включают в себя внутреннюю контрольную популяцию тимоцитов коровы с известной длиной теломер, определяемой TRF или анализом рестрикционных фрагментов теломер, с которым можно сравнивать флуоресценцию данного неизвестного образца. Поскольку тимоциты коровы поглощают краситель LDS751 в меньшей степени, чем их аналоги человека, их можно надежно дифференцировать с помощью построения графиков и стробирования желаемых популяций. Другие типы клеток, которые в прошлом не были признаны хорошими кандидатами для проточной FISH, могут быть проанализированы путем извлечения ядер и применения этого метода непосредственно на них.[10]

Многопараметрический анализ позволяет дифференцировать типы клеток в одном образце, обеспечивая внутренний контроль и анализ подтипов лейкоцитов.

Рекомендации

  1. ^ а б Баерлохер GM, Vulto I, de Jong G, Lansdorp PM. Проточная цитометрия и FISH для измерения средней длины теломер (flow FISH). Nat Protoc 2006; 1: 2365–2376.
  2. ^ Мойзис, Р. и другие. Высококонсервативная повторяющаяся последовательность ДНК (TTAGGG) n, присутствующая в теломерах хромосом человека. Proc. Natl. Акад. Sci. USA 85, 6622–6626 (1988).
  3. ^ Харли, К. Б., Футчер, А. Б. И Грейдер, К.В. Теломеры укорачиваются при старении фибробластов человека. Nature 345, 458–460 (1990).
  4. ^ Чанг, С., Кху, К.М., Нейлор, М.Л., Мазер, Р.С. И ДеПиньо, Р.А. Теломерный кризис: функциональные различия между активацией теломеразы и АЛТ при прогрессировании опухоли. Genes Dev. 17, 88–100 (2003).
  5. ^ Руфер Н., Бруммендорф Т.Х., Колвраа С. и др. Измерения флуоресценции теломер в субпопуляциях гранулоцитов и Т-лимфоцитов указывают на высокий оборот гемопоэтических стволовых клеток и Т-клеток памяти в раннем детстве. J Exp Med 1999; 190: 157–167.
  6. ^ Rufer, N., Dragowska, W., Thornbury, G., Roosnek, E. & Lansdorp, P.M. Динамика длины теломер в субпопуляциях лимфоцитов человека, измеренная методом проточной цитометрии. Nature Biotechnol. 16, 743–747 (1998).
  7. ^ Egholm, M. et al. ПНК гибридизуется с комплементарными олигонуклеотидами, подчиняясь правилам образования водородных связей Уотсона-Крика. Nature 365, 566–568 (1993).
  8. ^ а б Лансдорп, П. и другие. Неоднородность длины теломер хромосом человека. Гм. Мол. Genet. 5, 685–691 (1996).
  9. ^ Баерлохер, Г. И Лансдорп, П. Измерение длины теломер в субпопуляциях лейкоцитов с помощью автоматизированной многоцветной проточной FISH. Cytometry A 55, 1–6 (2003).
  10. ^ Wieser, M. et al. Ядерный поток FISH: изоляция ядер клеток улучшает определение длины теломер. Exp. Геронтол. 41, 230–235 (2006).

внешняя ссылка

Опубликованный протокол (поток FISH)