Микроскопия спектра сил - Force spectrum microscopy

Силовая спектральная микроскопия (FSM) это приложение активного микрореология разработан для измерения совокупных случайных сил в цитоплазма.^[1] Большой, инертный индикаторы потока вводятся в живые клетки и оседают внутри цитоскелет mesh, в которой он колеблется в результате воздействия активных моторных белков. О величине этих случайных сил можно судить по частоте колебаний индикаторных частиц. Отслеживание колебаний индикаторных частиц с помощью оптической микроскопии может изолировать вклад активных случайных сил во внутриклеточный молекулярный транспорт от вклада Броуновское движение.

Основные принципы

FSM был разработан Мин Го и Дэвид А. Вайц для исследования стохастических внутриклеточных сил, генерируемых моторными белками.^[1] Вдали от жидкой пустоты цитоплазма содержит сложную сеть из актин и миозин придание структурной поддержки ячейке, а также укрытие пузырьки и митохондрии среди других органелл.^[2] Недавние исследования макромолекулярное скопление внутри цитоплазмы возникает вопрос, не было ли диффузионное движение больших молекул ошибочно приписано броуновским силам.^[3] Вместо этого есть подозрения, что миозин моторные белки, которые беспорядочно тянут актиновые филаменты, встроенные в большие молекулы, вызывают движение молекул внутри клеток, подобное диффузии.^[3][4] Guo et al. разработали анализ, позволяющий определить, происходит ли движение частиц внутри клеток за счет тепловой диффузии или за счет воздействия активных моторных белков, таких как немышечный миозин II, сотрясающего клеточный цитоскелет.

FSM полагается на введение частиц индикатора, покрытых полиэтиленгликоль (ПЭГ) больше, чем размер ячейки цитоскелета (> 50 нм),^[5] оседая между сетью актиновых филаментов и моторных белков миозина. Поскольку миозиновые моторные белки тянут за актиновые филаменты для выполнения клеточной работы, эти колебания актина неизменно вызывают колебания соседних ПЭГилированных частиц. Величина колебания индикатора пропорциональна величине совокупных активных двигательных сил. Таким образом, регистрируя смещение трассерных колебаний, FSM может измерять и определять величину сил, оказываемых активными моторными белками.^[1]

Измерение силы

Колебания пегилированных индикаторов, связанных с агрегированными моторными силами миозина, можно сравнить с Hookean весна,

${ Displaystyle F = kx}$

где сила ${ displaystyle F}$ применяется для создания колебательного смещения ${ displaystyle x}$ пропорциональна эффективной жесткости пружины ${ displaystyle k}$ внутриклеточной среды. Смещение во время колебаний является пространственной функцией времени, которую можно напрямую измерить с помощью оптической микроскопии.^[1] А преобразование Фурье затем отображает информацию во временной области в частотную, чтобы получить полезный размер как функцию частоты,

${ Displaystyle langle left (F (v) right) ^ {2} rangle = langle left (K (v) right) ^ {2} rangle * langle left (x (v) right) ^ {2} rangle}$

куда ${ Displaystyle langle влево (F (v) вправо) ^ {2} rangle}$, ${ Displaystyle langle влево (К (v) вправо) ^ {2} rangle}$ и ${ Displaystyle langle влево (х (v) вправо) ^ {2} rangle}$ - квадратичные формы усредненной силы, эластичность и смещение, используемое для учета стохастических сил.^[1] Усредненное по времени Среднеквадратичное смещение, ${ Displaystyle MSD = langle влево (X (т) вправо) ^ {2} rangle}$ может быть получен преобразованием Фурье из частотной области обратно во временную область. В контексте частоты колебаний, чем выше частотный спектр силы, тем выше метаболическая активность клетки.^[6]Независимые микромеханические измерения позволяют рассчитать эластичность цитоплазмы. Используя оптический пинцет чтобы приложить заданную силу к индикаторной частице, FSM может измерить результирующее смещение, чтобы оценить жесткость упругой пружины.^[7][8]

Приложения

Цитоплазматическая текучесть

Направленное колебание индикаторных частиц с помощью оптического пинцета приводило к смещению, которое было почти синхронизировано с приложенной силой, предполагая, что цитоплазма существенно ближе к упругому твердому телу.^[1] Это резко контрастирует с предыдущей гипотезой о том, что цитоплазма представляет собой вязкоупругую жидкость, в которой большие молекулы могут свободно диффундировать.^[9] В АТФ -истощенные клетки, в которых инактивирован немышечный миозин II, эксперименты с FSM показывают, что частицы-индикаторы перестают колебаться, как если бы цитоплазма затвердела.^[1] Миозин II - это моторные белки, которые связываются с актиновыми филаментами и тянут за них посредством гидролиза АТФ.^[10] Это еще раз подтверждает вывод о том, что при недостатке питательных веществ бактерии цитоплазма переходит в стеклообразное вещество.^[11] Таким образом, АТФ-гидролиз моторными белками, по-видимому, имеет решающее значение для поддержания текучести цитоплазмы, которая имеет решающее значение для транспорта везикул и диффузионного движения в цитоскелете.^[1]

Дифференциальный диагноз злокачественного рака

Измеряя общее состояние активности внутри ячейки, автомат можно применять для идентификации злокачественный раковые клетки, которые обычно более эластичны^[12] и более подвижный. Измерения FSM на злокачественных MCF-7 клетки рака груди и доброкачественные MCF-10A клетки рака молочной железы выявили статистически значимое разделение силового спектра, которое позволяет FSM анализировать метастатический рак.^[1] Размерность внеклеточной среды сильно влияет на измерения FSM раковых клеток. В 3D-матрице MDA-MB-231 клетки метастатического рака молочной железы имели сравнительно более твердую цитоплазму, чем их аналоги, культивированные на 2D-чашках.^[13]

Рекомендации