Биореактор из полого волокна - Hollow fiber bioreactor

А Биореактор из полого волокна это трехмерный культивирование клеток система на основе полых волокон небольшого размера, полупроницаемых капилляр мембраны расположены в параллельном ряду с типичным молекулярный вес предел отсечки (MWCO) 10-30 кДа. Эти мембраны из полого волокна часто объединяются и размещаются внутри трубчатых поликарбонат оболочки для создания картриджей из полых волоконных биореакторов. Внутри картриджей, которые также снабжены входными и выходными портами, есть два отсека: внутрикапиллярное (IC) пространство внутри полых волокон и экстракапиллярное (EC) пространство, окружающее полые волокна.

Клетки засеваются в пространство ЭК полого волоконного биореактора и там расширяются. Среда для культивирования клеток прокачивается через пространство IC и доставляет кислород и питательные вещества к клеткам через перфузию половолоконной мембраны. По мере расширения клеток их отходы и CO2 также перфузируют мембраны из полых волокон и уносятся перекачкой среды через пространство IC. Поскольку продукты жизнедеятельности накапливаются из-за увеличения массы клеток, скорость потока среды также может быть увеличена, чтобы рост клеток не подавлялся токсичностью продуктов жизнедеятельности.

Поскольку тысячи полых волокон могут быть упакованы в один биореактор из полых волокон, они увеличивают площадь поверхности картриджа значительно. В результате клетки могут заполнить пространство ЭК до плотности> 108 клеток / мл. Однако сам картридж занимает очень небольшой объем (часто это объем банки содовой на 12 унций). Тот факт, что биореакторы из полого волокна очень малы, но при этом обеспечивают невероятно высокую плотность клеток, привел к их разработке как для исследовательских, так и для коммерческих приложений, в том числе моноклональное антитело и вакцина против гриппа[1] производство. Аналогичным образом, поскольку в биореакторах с полыми волокнами используется значительно меньше среды и факторов роста, чем в традиционных методах культивирования клеток, таких как биореакторы с мешалкой, они предлагают значительную экономию средств. Наконец, биореакторы из полого волокна продаются как одноразовые, что позволяет значительно сэкономить время лабораторного персонала и технических специалистов.

История

В 1972 году Ричард Кназек[2] группа в Национальные институты здравоохранения США сообщил, как мышь фибробласты культивированные на 1,5 см3 капиллярные мембраны из полых волокон, состоящие из ацетат целлюлозы смогли сформировать узелки шириной 1 мм за 28 дней. Группа записала окончательное количество клеток примерно 1,7 x 10.7 ячеек из стартовой партии всего 200 000 ячеек. Когда одна и та же группа культивировала человека хориокарцинома ячейки на полимерных и силиконовых поликарбонатных капиллярных мембранах общим размером менее 3 см3 по объему клетки расширились примерно до 2,17 x 108 клетки.

Группа Knazek получила патент на технологию полых волоконных биореакторов в 1974 году.[3] На основе этой запатентованной технологии компании начали строительство полых волоконных биореакторов различных и более крупных (коммерческих) масштабов, причем в конце 1980-х - начале 1990-х годов произошли значительные разработки и технологические усовершенствования. К 1990 году по крайней мере три компании предлагали коммерчески доступные биореакторы из полого волокна.[4]

Одним из инженерных достижений стало добавление газообменного картриджа, что позволило лучше контролировать работу системы. pH и уровни кислорода. Похоже на легкое млекопитающих газообменный картридж эффективно насыщал кислородом культуральную среду, позволяя биореактору поддерживать большее количество клеток. В сочетании с возможностью добавления или удаления CO2 для точного контроля pH были устранены ограничения, обычно связанные с крупномасштабной культурой клеток, в результате чего были получены плотно упакованные культуры клеток, которые можно было поддерживать в течение нескольких месяцев.

Кроме того, контроль динамика жидкостей внутри каждого биореактора из полых волокон привело к дальнейшей оптимизации среды для культивирования клеток. Путем чередования градиент давления Через мембрану из полых волокон среда может течь вперед и назад между стороной ЭК (отсек для кюветы) и стороной IC (просвет полого волокна). Этот процесс в сочетании с осевым потоком среды, создаваемым, когда среда проходит по длине волокон, оптимизировал среду для роста во всем биореакторе.

Эта концепция называется EC-велоспортом.[5] и был разработан как решение проблемы градиентов, которые образуются внутри полых волоконных биореакторов, когда среда проталкивается вниз по длине их волокон. Выше гидростатическое давление на осевом конце (среда, входящая в просвет волокна) по сравнению с дистальным концом биореактора создает Скворец флоу в пространстве ЭК, что аналогично тому, что наблюдается в теле. Это явление также создает богатую питательными веществами осевую область и обедненную питательными веществами дистальную область внутри биореактора. За счет включения цикла EC устраняются эффекты потока Starling, и весь биореактор становится богатым питательными веществами и оптимизирован для роста клеток.

Оптимальные скорости перфузии пространства IC и EC должны быть достигнуты для эффективной доставки питательных веществ в среду и добавок для роста, соответственно, и для сбора супернатанта. Во время фазы роста клеток в этих биореакторах скорость подачи среды увеличивается, чтобы вместить увеличивающуюся популяцию клеток. Более конкретно, скорость перфузии среды IC увеличивается, чтобы обеспечить клетки дополнительной глюкозой и кислородом при постоянном удалении метаболические отходы Такие как молочная кислота. Когда пространство ячеек полностью заполнено ячейками, скорость подачи среды выходит на плато, что приводит к постоянному глюкоза потребление, потребление кислорода и выработка лактата.

Приложения

С введением гибридомной технологии в 1975 г.[6] клеточная культура может применяться для получения секретируемых белков, таких как моноклональные антитела, гормоны роста, и даже некоторые категории вакцин. Чтобы производить эти белки в промышленных масштабах, необходимо было разработать новые методы культивирования больших партий клеток. Одним из таких технологических достижений стал биореактор из полых волокон.

Биореакторы с полым волокном используются для получения высоких концентраций продуктов клеточного происхождения, включая моноклональные антитела, рекомбинантные белки, факторы роста, вирусы и вирусоподобные частицы. Это возможно, потому что полупроницаемые мембраны из полых волокон позволяют пропускать низкомолекулярные питательные вещества и отходы из содержащих клетки ЭК в не содержащее клетки пространство ИК, но они не позволяют проникать более крупным продуктам, таким как антитела. Следовательно, по мере того, как клеточная линия (например, гибридома) расширяется и экспрессирует целевой белок, этот белок остается в пространстве ЭК и не вымывается. В определенный момент времени (или постоянно во время культивирования) супернатант урожая (продукт) собирается, очищается и охлаждается для последующего применения в будущем.

Биореакторы из полого волокна меньшего размера часто используются для выбора и оптимизации Сотовые линии[7][8] до перехода к более крупным системам культивирования клеток. Это позволяет сэкономить на факторах роста, поскольку значительная часть среды для культивирования клеток не требует добавления дорогих компонентов, таких как фетальная бычья сыворотка. Точно так же биореакторы из полого волокна меньшего размера могут быть размещены в лабораторном инкубаторе, как планшеты и колбы для культивирования клеток.

Недавно биореакторы из полых волокон были испытаны как новые платформы для коммерческого производства вируса гриппа A с высоким титром.[9] В этом исследовании адгезивные и суспензионные эпителиальные клетки почек собак Madin-Darby (MDCK) были инфицированы двумя разными штаммами гриппа: A / PR / 8/34 (H1N1) и пандемическим штаммом A / Mexico / 4108/2009 ( H1N1). Высокие титры были достигнуты как для суспензии, так и для прикрепленных штаммов; кроме того, было обнаружено, что технология половолоконных биореакторов сравнима по производственной мощности с другими коммерческими биореакторами на рынке, включая классические биореакторы с мешалкой и волновые биореакторы (Wave) и системы перфузии ATF.

Рекомендации

  1. ^ Хиршель М., Гангеми Дж. Д., МакШарри Дж., Майерс К. Новые возможности использования полых волоконных биореакторов Новости генной инженерии 15 июня 2011 г. (Том 31, № 12).
  2. ^ Кназек Р.А., Гуллино П.М., Колер П.О., Дедрик Р.Л. Культура клеток на искусственных капиллярах: подход к росту тканей in vitro. Наука. 1972 6 октября; 178 (4056): 65-6.
  3. ^ Культура клеток на полупроницаемых трубчатых мембранах Патент США US 3821087 A
  4. ^ Ахерн, Х. Системы биореакторов с полым волокном увеличивают урожайность клеточных культур Журнал "Ученый" (1990)
  5. ^ Система и метод круговорота экстракапиллярной жидкости для культивирования клеток. Патент США US 20130058907 A1
  6. ^ Колер, Г. и К. Мильштейн. 1975 г. Непрерывные культуры слитых клеток, секретирующих антитела заданной специфичности. Природа 256: 495.
  7. ^ Грамер, MJ. Бриттон Т.Л. Отбор и выделение клеток для оптимального роста в биореакторах с полым волокном Hybridoma 2000. 19 (5): 407-412.
  8. ^ Де Наполи, Илария Э .; Zanetti, Elisabetta M .; Фрагомени, Джионата; Джузио, Эрменегильдо; Audenino, Alberto L .; Катапано, Херардо (2014). «Транспортное моделирование биореакторов с половолоконными мембранами, усиленных конвекцией, для терапевтического применения». Журнал мембрановедения. 471: 347–361. Дои:10.1016 / j.memsci.2014.08.026.
  9. ^ Тапиа, Ф. и другие. Получение вируса гриппа А человека с высоким титром с прилипшими и суспензионными клетками MDCK, культивируемыми в одноразовом биореакторе с полыми волокнами Vaccine 32 (2014): 1003-1011.