MARCM - MARCM

Мозаичный анализ с репрессируемым клеточным маркером, или же MARCM, это генетика техника создания индивидуальной надписи гомозиготный ячеек в другом гетерозиготный Drosophila melanogaster.[1] Это был важный инструмент в изучении развития Дрозофила нервная система. Этот метод основан на рекомбинация в течение митоз при посредничестве Рекомбинация FLP-FRT. Как одна копия гена, предоставленная балансирная хромосома, часто бывает достаточно, чтобы спасти мутанта фенотип, Клоны MARCM могут быть использованы для изучения мутантного фенотипа в другом дикого типа животное.

Кресты

Визуальное изображение MARCM

Чтобы пометить небольшие популяции клеток из общего прародитель, MARCM использует Система GAL4-UAS. Маркерный ген, такой как GFP находится под управлением БПЛА промоутер. GAL4 повсеместно экспрессируется у этих мух, таким образом управляя экспрессией маркеров. Кроме того, GAL80 управляется сильным промотором, таким как tubP. Gal80 ингибитор GAL4, и подавит экспрессию GFP в нормальных условиях. Этот элемент tubP-GAL80 размещается дистальнее области FRT. Второй сайт FRT помещается в транс к сайту GAL80, обычно с интересующим геном или мутацией, удаленными от него. Наконец, рекомбиназа FLP управляется индуцибельным промотором, таким как тепловой шок.

Когда транскрипция FLP индуцируется, он рекомбинирует хромосомы в двух сайтах FRT в клетках, подвергающихся митозу. Эти клетки разделятся на две гомозиготные дочерние клетки - одна несет оба элемента GAL80, а другая не несет ни одного. Дочерняя клетка, лишенная GAL80, будет помечена из-за экспрессии маркера через систему GAL4-UAS. Все последующие дочерние клетки от этого предшественника также будут экспрессировать маркер.

В лабораториях часто есть готовые к MARCM линии, которые имеют индуцибельный FLP, GAL80 дистальнее участка FRT, GAL4 и UAS-маркер. Их можно легко скрестить с мухами, у которых есть интересующая мутация дистальнее сайта FRT.[2]

Схема скрещивания дрозофилы для получения потомства для исследований MARCM

Использует

Воспользовавшись преимуществами MARCM, можно легко отследить все клетки, которые были созданы из одного предшественника. Это полезный инструмент для отслеживания развития и конкретных клеточных клонов в различных условиях окружающей среды. Заявки на MARCM включают обучение нейронные цепи,[3] клональный анализ,[4] генетические экраны,[5] сперматогенез,[6] конус роста разработка,[7] нейрогенез,[8] и метастаз опухоли.[9]

Многие успехи в понимании развития Drosophila были достигнуты с помощью MARCM. Развитие, происхождение и характеристики вторичных трактов аксонов,[10] анатомические карты холинергические нейроны в зрительных системах,[11] линии, дающие начало грудному каркасу геминуромер и каркас развития для архитектуры ЦНС,[12] роль Дельта в программировании развития брюшного нервного канатика,[13] стимулирующие пробуждение октопаминергические клетки в медиальном протоцеребрум,[14] гены, участвующие в морфогенезе нейронов грибовидные тела,[15] и регуляция комиссурального управление аксоном[16] все были идентифицированы с помощью методов MARCM.

Вариации

Существует множество разновидностей MARCM. Twin-spot MARCM позволяет маркировать сестринские клоны двумя отдельными маркерами, что обеспечивает более высокое разрешение отслеживания клонов.[17] В обратном MARCM интересующая мутация помещается в ту же хромосому, что и GAL80, так что гомозиготные клоны дикого типа будут помечены.[18] Flip-Out MARCM выделяет отдельные клетки внутри мутантных клонов (см. «Drosophila Dscam необходим для дивергентной сегрегации сестринских ветвей и подавляет эктопическую бифуркацию аксонов», Neuron, 2002). Система Q позволяет использовать MARCM, независимый от GAL4, с помощью системы QF / QS.[19] Летальный MARCM позволяет создавать большие помеченные гомозиготные популяции, включая летальную мутацию рядом с сайтом GAL80.[20] Контроль двойной экспрессии MARCM использует транскрипционную систему LexA-VP16 в соответствии с GAL4-UAS.[21] MARCM также часто используется в качестве генетического скрининга.[15]

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ Wu, JS; Луо Л. (11 января 2007 г.). «Протокол мозаичного анализа с маркером репрессируемых клеток (MARCM) в Drosophila». Протоколы природы. 1 (6): 2583–9. Дои:10.1038 / nprot.2006.320. PMID  17406512.
  2. ^ Marin, E.C .; Джефферис Г.С.; Komiyama T; Zhu H; Ло Л. (19 апреля 2002 г.). «Представление клубочковой обонятельной карты в головном мозге дрозофилы». Клетка. 109 (2): 243–55. Дои:10.1016 / S0092-8674 (02) 00700-6. PMID  12007410.
  3. ^ Lai, SL; Awasaki T; Ито К; Ли Т. (01.09.2008). «Клональный анализ нейронов антеннальной доли дрозофилы: разнообразная нейрональная архитектура в клане латеральных нейробластов». Разработка. 135 (17): 2883–2893. Дои:10.1242 / dev.024380. PMID  18653555.
  4. ^ Баер, ММ; Bilstein A; Лептин М. (01.07.2007). «Клональный генетический скрининг мутантов, вызывающих дефекты личиночного морфогенеза трахеи у Drosophila». Генетика. 176 (4): 2279–91. Дои:10.1534 / genetics.107.074088. ЧВК  1950631. PMID  17603107.
  5. ^ Кигер, АА; Уайт-Купер H; Фуллер МТ. (2000-10-12). «Соматические поддерживающие клетки ограничивают самообновление стволовых клеток зародышевой линии и способствуют дифференцировке». Природа. 407 (6805): 750–4. Дои:10.1038/35037606. PMID  11048722.
  6. ^ Ng, Дж; Нардин Т; Хармс М; Цзы Дж; Гольдштейн А; Вс Y; Dietzl G; Диксон Би Джей; Луо Л. (28 марта 2002 г.). «Rac GTPases контролируют рост, наведение и ветвление аксонов». Природа. 416 (6879): 422–47. Дои:10.1038 / 416442a. PMID  11919635.
  7. ^ Ben Rokia-Mille, S .; Tinette S; Engler G; Arthaud L; Tares S; Робишон А. (11.06.2008). «Продолжение нейрогенеза у взрослых дрозофил как механизм привлечения вариантов, зависимых от внешних сигналов». PLoS ONE. 3 (6): e2395. Дои:10.1371 / journal.pone.0002395. ЧВК  2405948. PMID  18545694. открытый доступ
  8. ^ Пальярини, РА; Сюй, Т. (09.10.2003). «Генетический скрининг дрозофилы на метастатическое поведение». Наука. 302 (5648): 1227–31. Дои:10.1126 / science.1088474. PMID  14551319.
  9. ^ Ловик, Дж. К.; Ngo KT; Омото JJ; Вонг, округ Колумбия; Nguyen JD; Хартенштейн В. (15.12.2013). «Постэмбриональные линии головного мозга дрозофилы: I. Развитие волоконных трактов, связанных с клонами». Биология развития. 384 (2): 228–57. Дои:10.1016 / j.ydbio.2013.07.008. ЧВК  3886848. PMID  23880429.
  10. ^ Вариджа Рагху, S; Reiff DF; Борст А. (01.01.2011). «Нейроны с холинергическим фенотипом в зрительной системе дрозофилы». Журнал сравнительной неврологии. 519 (1): 162–76. Дои:10.1002 / cne.22512. PMID  21120933.
  11. ^ Трумэн, JW; Schuppe H; Пастух Д; Уильямс DW. (2004-10-15). «Архитектура развития взрослых специфических клонов в вентральной ЦНС Drosophila». Разработка. 131 (20): 5167–84. Дои:10.1242 / dev.01371. PMID  15459108.
  12. ^ Корнбрукс, К; Bland C; Уильямс DW; Трумэн JW; Rand MD. (2006-12-22). «Дельта-экспрессия в постмитотических нейронах позволяет идентифицировать отдельные подмножества специфичных для взрослых клонов у дрозофилы». Нейробиология развития. 67 (1): 23–38. Дои:10.1002 / dneu.20308. PMID  17443769.
  13. ^ Крокер, А; Шахидулла М; Левитан И.Б .; Сегал А. (11.03.2010). «Идентификация нейронной цепи, которая лежит в основе воздействия октопамина на сон: поведение при бодрствовании». Нейрон. 65 (5): 670–81. Дои:10.1016 / j.neuron.2010.01.032. ЧВК  2862355. PMID  20223202.
  14. ^ а б Reuter, JE; Нардин ТМ; Пентон А; Billuart P; Скотт EK; Усуи Т; Uemura T; Луо Л. (15 марта 2003 г.). «Мозаичный генетический скрининг генов, необходимых для морфогенеза нейронов грибовидных тел дрозофилы». Разработка. 130 (6): 1203–13. Дои:10.1242 / dev.00319. PMID  12571111.
  15. ^ Макговерн, В.Л .; Сигер, Массачусетс. (2003-10-20). «Мозаичный анализ показывает клеточно-автономную нейронную потребность в Commissureless в ЦНС дрозофилы». Гены развития и эволюция. 213 (10): 500–4. Дои:10.1007 / s00427-003-0349-1. PMID  12928898.
  16. ^ Yu, HH; Chen CH; Ши Л; Хуанг Y; Ли Т. (14 июня 2009 г.). «Двойная точка MARCM для выявления происхождения и идентичности нейронов». Природа Неврология. 12 (7): 947–53. Дои:10.1038 / №2345. ЧВК  2701974. PMID  19525942.
  17. ^ Ли, Т; Winter C; Мартике СС; Ли А; Ло Л (2000). «Основные роли Drosophila RhoA в регуляции пролиферации нейробластов и дендритного, но не аксонального морфогенеза». Нейрон. 25 (2): 307–16. Дои:10.1016 / S0896-6273 (00) 80896-X. PMID  10719887.
  18. ^ Поттер, CJ; Tasic B; Русслер Э.В.; Liang L; Луо Л. (30 апреля 2010 г.). «Система Q: подавляемая бинарная система для экспрессии трансгена, отслеживания клонов и мозаичного анализа». Клетка. 141 (3): 536–48. Дои:10.1016 / j.cell.2010.02.025. ЧВК  2883883. PMID  20434990.
  19. ^ Чжу, H; Луо Л. (2004-04-08). «Разнообразные функции N-кадгерина в дендритных и аксональных терминальных ветвлениях нейронов обонятельной проекции». Нейрон. 42 (1): 63–75. Дои:10.1016 / S0896-6273 (04) 00142-4. PMID  15066265.
  20. ^ Lai, SL; Ли Т. (09.05.2006). «Генетическая мозаика с двойными бинарными системами транскрипции у дрозофилы». Природа Неврология. 9 (5): 703–9. Дои:10.1038 / nn1681. PMID  16582903.