Нападение на промоутеров - Википедия - Promoter bashing

Промоутер треп
Защита от промотора гипотетического двухрегионального промотора. Промотор клонирован перед lacZ. репортерный ген. Производятся точечные мутации, которые инактивируют каждую область (красные крестики), и область клонируется на плазмида и вставлен в Кишечная палочка клетки, выросшие, и наличие репортера измерено. Связывание протеина B в этом примере необходимо для РНК-полимераза связывать и инициировать транскрипция.
В лабораторных условиях может не быть известно, что промотор состоит из двух областей - могут быть сделаны одиночные мутации вдоль промотора, промотор может быть последовательный, и уровни репортера испытанный найти границы для каждого региона.

Треск промоутера это техника, используемая в молекулярная биология определить, как определенные регионы Цепь ДНК, обычно промоутеры, влиять на транскрипция нижестоящих генов. При нормальных обстоятельствах, белки связываются с промотором и активируют или репрессируют транскрипцию. В избиении промоутера проба, специфический точечные мутации или же удаления сделаны в определенных регионах промоутера и транскрипция гена затем измеряется. Вклад области промотора можно наблюдать по уровню транскрипции. Если мутация или делеция изменяют уровень транскрипции, то известно, что эта область промотора может быть сайтом связывания или другим регуляторным элементом.[1][2][3]

Обстрел промоутера часто осуществляется с удалением из 5' или же 3' конец цепи ДНК; этот анализ легче выполнить на основе повторных ограничение пищеварения и гель-очищающий фрагменты определенных размеров. Часто проще всего лигировать промотор в репортер, сгенерировать большое количество репортерной конструкции с помощью ПЦР или роста бактерий, а затем выполнить серию рестрикционных перевариваний этого образца. Способность вышележащих промоторов можно легко оценить, удалив сегменты с 5'-конца, и то же самое для 3'-конца цепи для нижележащих промоторов.[4]

Поскольку промотор обычно содержит связывающие последовательности для белков, влияющих на транскрипцию, эти белки также необходимы при тестировании эффектов промотора. Белки, которые связываются с промотором, можно идентифицировать с помощью анализ сдвига электрофоретической подвижности (EMSA), и эффекты включения или исключения белков с мутагенизированными промоторами могут быть оценены в анализе. Это позволяет использовать промоторный удар не только для обнаружения местоположения на цепи ДНК, которое влияет на транскрипцию, но и для определения белков, которые влияют на эту цепь. Таким же образом можно анализировать эффекты взаимодействия белков друг с другом, а также сайты связывания; Вместо этого белки-кандидаты должны быть идентифицированы с помощью анализов взаимодействия белок / белок вместо EMSA.[5]

Процедура

Это пример процедуры анализа промотора, адаптированный из Boulin. и другие.:[6]

  1. Клонируйте участок ДНК, который, как считается, действует как промотор. Клонирование необходим для анализа, поскольку он гарантирует, что промотор является единственным фактором, влияющим на экспрессию. Этот этап часто включает извлечение ДНК из организма, в котором она находится, и ПЦР усиление.
  2. Последовательность региона. Секвенирование ДНК необходимо для выявления отличий мутантных промоторов от промотора дикого типа и для корреляции этих различий с различиями в экспрессии генов. Кроме того, это помогает с ограничением переваривания региона.
  3. Переваривайте подходящими эндонуклеазами рестрикции. Область может быть переварена для удаления элементов, которые, как считается, не являются частью промотора. Кроме того, для большинства промоторов репортерный ген должен быть вставлен на заданном расстоянии от промотора. В некоторых методах защиты от промотора используются множественные рестрикционные переваривания для систематического удаления элементов промоторов - этот метод гарантирует, что области удаленного промотора не влияют на репортер. выражение.
  4. Мутагенизируйте промотор. Мутация промотора необходима, если не используется метод удаления части промотора с рестрикционным перевариванием. Можно создать множество мутированных цепей, секвенировать цепи и проанализировать активность промоторов. Это часто необходимо, потому что нельзя гарантировать, что одна мутация деактивирует сайт связывания. Также можно использовать ненаправленный мутагенез на основе ПЦР; параметры мутагенной реакции ПЦР могут быть скорректированы, чтобы ввести разумное количество мутаций. Однако случайный характер ПЦР требует, чтобы после этого этапа было проанализировано больше цепей.
  5. Свяжите с репортерным геном. Промоторы для анализа должны быть лигированы с репортерный ген чтобы можно было измерить уровни экспрессии генов. Репортерный ген должен находиться на достаточном расстоянии от промотора, чтобы промотор воздействовал на него, как промотор дикого типа мог бы воздействовать на ген. Это можно проверить с помощью положительного контроля (полный промотор).
  6. Трансформируйте интересующие клетки с помощью различных промоторных: репортерных конструкций. Конструкции промотора и репортера должны быть лигированы в плазмиду и трансформированы в клетки, в которых эта плазмида может экспрессироваться для измерения активности каждой промоторной последовательности. К этим клеткам также должны быть добавлены белки, которые влияют на промотор - часто эти белки помещаются в одну или разные плазмиды под контролем конститутивно активного промотора.
  7. Измерьте скорость транскрипции репортерного гена. Генные продукты анализируются и измеряются скорости репортерной транскрипции.

По данным, полученным при анализе различных промоторов, можно установить эффекты различных частей промотора. Однако возможно, что данных может быть недостаточно, и анализ необходимо повторно запустить с другой промоторной областью и / или другими мутациями.

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ Камвисселис М. (2003). Вычислительная молекулярная геномика: гены, регуляция, эволюция. (Докторская диссертация). Извлекаются из http://web.mit.edu/manoli/www/thesis/Intro.html
  2. ^ Чалфи, М., и Каин, С. (2005) Методы биологических анализов, зеленый флуоресцентный белок: свойства, применение и протоколы. Вайли.
  3. ^ Мацукура, С., Стеллато, К., Плитт, Дж. Р., Бикель, К., Миура, К., Георас, С. Н., Казоларо, В., Шлеймер, Р. П. (1999). "Активация транскрипции гена эотаксина NF-κB и STAT6 в эпителиальных клетках дыхательных путей человека". J Immunol 163:6876-6883. PMID 10586089.
  4. ^ Энгстрем, Э. М., Ижаки, А., Боуман, Дж. Л. (2004). «Промоторный удар, микроРНК и гены Knox. Новые идеи, регуляторы и мишени регуляции в установлении латеральной полярности органов у Arabidopsis». Растение Физиол 135(2): 685-94. Дои: 10.1104 / стр.104.040394. PMID 15208415. ЧВК 514105.
  5. ^ Го, Дж. Ю., Сюй, Дж., Мао, Д. К., Фу, Л. Л., Гу, Дж. Р., Чжу, Дж. Д. (2002). "Промоторный анализ человеческого C17orf25 ген, новый ген хромосомы 17p13.3 ". Клеточные исследования 12:339-352. Дои:10.1038 / sj.cr.7290136.
  6. ^ Boulin, T. et al. Слияния репортерных генов (5 апреля 2006 г.), WormBook, изд. Исследовательское сообщество C. elegans, WormBook, Дои 10.1895 / wormbook.1.106.1, http://www.wormbook.org.