Профилирование рибосом - Ribosome profiling

На изображении показан фрагмент РНК сообщения с 5 рибосомами в процессе трансляции белка. Первым шагом в профилировании рибосом является переваривание сигнальной РНК ферментом рибонуклеазой, который расщепляет всю информационную РНК, за исключением 5 маленьких частей, которые защищены, потому что они окружены рибосомами. Затем из маленьких кусочков РНК удаляются белки и определяются последовательности оснований маленьких кусочков. Путем сравнения этих последовательностей с последовательностью гена указываются точные положения рибосом.
Кратко о профилировании рибосом

Профилирование рибосом, или же Ribo-Seq (также названный следы рибосом), представляет собой адаптацию методики, разработанной Джоан Стейтц и Мэрилин Козак почти 50 лет назад Мириам Хейман и Пол Грингард - и отдельно Николас Инголия и Джонатан Вайсман - адаптирован для работы с секвенирование следующего поколения который использует специализированную информационную РНК (мРНК ) секвенирование, чтобы определить, какие мРНК активно используются переведено.[1][2][3]


Он создает «глобальный снимок» всех рибосомы активен в клетка в определенный момент, известный как переводчик. Следовательно, это позволяет исследователям определить местонахождение перевод стартовые сайты, комплект переведенных ORF в клетке или ткани, распределение рибосом на информационной РНК и скорость трансляции рибосом.[4] Профилирование рибосом включает в себя подготовку библиотеки секвенирования и анализ данных, аналогичные РНК-Seq, но в отличие от RNA-Seq, которая определяет последовательность всей мРНК данной последовательности, присутствующей в образце, профилирование рибосом нацелено только на последовательности мРНК, защищенные рибосомой в процессе декодирования путем трансляции.[2] Эта техника отличается от полисомное профилирование.

История

Профилирование рибосом основано на открытии того факта, что мРНК внутри рибосомы можно выделить с помощью нуклеазы которые разрушают незащищенные участки мРНК. Этот метод анализирует участки мРНК, конвертируемые в белок, а также уровни трансляции каждой области, чтобы получить представление о глобальной экспрессии генов. До его разработки усилия по измерению трансляции in vivo включали микроматричный анализ на РНК, выделенной из полисомы, а также трансляционное профилирование через аффинная очистка рибосом, меченных эпитопом. Это полезные и дополнительные методы, но ни один из них не позволяет получить информацию о чувствительности и положении, полученную при профилировании рибосом.[4]

Использует

Существует три основных применения профилирования рибосом: определение транслируемых участков мРНК, наблюдение за тем, как зарождаются пептиды складываются и измеряют количество синтезируемых конкретных белков.

Идентификация транслируемых участков мРНК

Используя определенные лекарства, профилирование рибосом может идентифицировать либо инициирующие области мРНК, либо удлиняющиеся области.[5] Инициирующие области можно обнаружить, добавив харрингтонин или лактидомицин, чтобы предотвратить дальнейшее инициирование.[5] Это позволяет стартовый кодон мРНК по всей клетке лизат для анализа, который был использован для определения не-AUG последовательностей, которые действительно инициируют перевод.[2] Другие удлиненные области можно обнаружить, добавив антибиотики, такие как циклогексимид которые подавляют транслокацию, хлорамфеникол который ингибирует перенос пептидов внутри рибосомы, или немедикаментозные средства, такие как термическое замораживание.[5] Эти методы замораживания при удлинении позволяют анализировать кинетику трансляции. Поскольку несколько рибосом могут транслировать одну молекулу мРНК для ускорения процесса трансляции, RiboSeq демонстрирует кодирующие белки области внутри мРНК и насколько быстро это делается в зависимости от секвенируемой мРНК.[2][6] Это также позволяет при профилировании рибосом отображать сайты паузы в транскриптом по конкретным кодонам.[6][7] Эти сайты медленной или приостановленной трансляции демонстрируются увеличением плотности рибосом, и эти паузы могут связывать определенные белки с их ролью в клетке.[2]

Сворачивание пептидов

Сопряжение профилирования рибосом с ЧИП может выяснить, как и когда сворачиваются вновь синтезированные белки.[2] Используя следы, предоставленные Ribo-Seq, можно очистить определенные рибосомы, связанные с факторами, такими как шапероны. Остановка рибосомы в определенных временных точках, позволяющая ей транслировать полипептид с течением времени, а также воздействие на разные точки шаперона и осаждение с помощью ChIP очищает эти образцы и может показать, в какой момент времени пептид сворачивается.[2]

Измерение синтеза белка

Ribo-Seq также можно использовать для измерения синтеза белка и его регуляторов. Это можно сделать, изначально разрушив белки, которые связываются с РНК, и используя профилирование рибосом для измерения различий в трансляции.[7] Эти нарушенные мРНК могут быть связаны с белками, чьи сайты связывания уже нанесены на карту РНК, чтобы указать на регуляцию.[2][7]

Процедура

  1. Лизируйте клетки или ткань и изолируйте молекулы мРНК, связанные с рибосомами.
  2. Иммобилизируйте комплексы. Обычно это выполняется с циклогексимид но можно использовать и другие химические вещества. Также можно отказаться от ингибиторов трансляции в условиях лизиса, неспособного к трансляции.
  3. С помощью рибонуклеаз переваривают РНК, не защищенную рибосомами.
  4. Изолируйте комплексы мРНК-рибосомы с помощью центрифугирования в градиенте плотности сахарозы или специальных хроматографических колонок.
  5. Фенол /хлороформ очистка смеси от белков.
  6. Выбор размера для ранее защищенных фрагментов мРНК.
  7. Привязать 3 'адаптер к фрагментам.
  8. Вычтите известные загрязнители рРНК (необязательно).
  9. Обратная транскрипция РНК в кДНК с помощью обратная транскриптаза.
  10. Усиление специфическим для нити образом.
  11. Последовательность читает.
  12. Совместите результаты последовательности с геномной последовательностью, чтобы определить профиль трансляции.[8]

Материалы

Рекомендации

  1. ^ Хейман М., Шефер А., Гонг С., Петерсон Д. Д., Дэй М., Рэмси К. Э.; и другие. (2008). «Подход трансляционного профилирования для молекулярной характеристики типов клеток ЦНС». Клетка. 135 (4): 738–48. Дои:10.1016 / j.cell.2008.10.028. ЧВК  2696821. PMID  19013281.CS1 maint: несколько имен: список авторов (связь)
  2. ^ а б c d е ж грамм час Ingolia NT (март 2014 г.). «Профилирование рибосом: новые взгляды на трансляцию, от отдельных кодонов до шкалы генома». Обзоры природы. Генетика. 15 (3): 205–13. Дои:10.1038 / nrg3645. PMID  24468696.
  3. ^ Догерти, Джозеф Д. (13 декабря 2017 г.). «Расширяющийся инструментарий для перевода очистки сродства рибосом». Журнал неврологии. 37 (50): 12079–12087. Дои:10.1523 / JNEUROSCI.1929-17.2017. Получено 2020-11-16.
  4. ^ а б Вайс РБ, Аткинс Дж.Ф. (декабрь 2011 г.). «Молекулярная биология. Перевод идет глобально». Наука. 334 (6062): 1509–10. Дои:10.1126 / science.1216974. PMID  22174241.
  5. ^ а б c Мишель А.М., Баранов П.В. (сентябрь 2013 г.). «Профилирование рибосом: монитор Hi-Def для синтеза белка в масштабе всего генома». Междисциплинарные обзоры Wiley: РНК. 4 (5): 473–90. Дои:10.1002 / wrna.1172. ЧВК  3823065. PMID  23696005.
  6. ^ а б Бускерк AR, Green R (март 2017 г.). «Приостановка, остановка и спасение рибосом у бактерий и эукариот». Философские труды Лондонского королевского общества. Серия B, Биологические науки. 372 (1716): 20160183. Дои:10.1098 / rstb.2016.0183. ЧВК  5311927. PMID  28138069.
  7. ^ а б c Андреев Д.Е., О'Коннор ПБ, Лофран Г., Дмитриев С.Е., Баранов П.В., Шацкий И.Н. (январь 2017 г.). «Понимание механизмов эукариотической трансляции, полученное с помощью профилирования рибосом». Исследования нуклеиновых кислот. 45 (2): 513–526. Дои:10.1093 / нар / gkw1190. ЧВК  5314775. PMID  27923997.
  8. ^ а б Ingolia NT, Ghaemmaghami S, Newman JR, Weissman JS (апрель 2009 г.). «Полногеномный анализ трансляции in vivo с разрешением нуклеотидов с использованием профилирования рибосом». Наука. 324 (5924): 218–23. Дои:10.1126 / science.1168978. ЧВК  2746483. PMID  19213877.

внешняя ссылка