Химера из цинкового пальца - Zinc finger chimera

Химера цинкового пальца находятся химерные белки состоит из ДНК-связывающего белок цинковых пальцев домен и другой домен, через который белок оказывает свое действие. Эффекторный домен может быть активатор транскрипции (А) или репрессор (Р),[1] домен метилирования (M) или нуклеаза (N).[2]

Модификация эндогенного ДНК-связывающего домена цинкового пальца является основой самой передовой области конструирования ген-специфичных факторы искусственной транскрипции.[1] Связывание вместе шести ZFP дает сайт-мишень длиной 18-19 п.н. Если предположить специфичность этой одной последовательности и то, что последовательность генома случайна, длина 18 п.н. достаточно, чтобы быть уникальной во всех известных геномах.[3][4] Действительно, расстояние между субсайтами становится частью последовательности-мишени из-за ограничений гибкости белка, которую можно контролировать.[1] Сайты нацеливания размером всего 9 п.н. обеспечивают некоторую степень специфичности, что почти наверняка частично связано с окклюзией хроматина.[4]

Производство домена белка цинкового пальца

В зависимости от требований исследования существует несколько доступных методов для определения домена распознавания ДНК, который придает специфичность фактора транскрипции на основе ZFP. Три фаговый дисплей Были описаны стратегии, включающие параллельный, последовательный или двусторонний выбор составляющих цинковых пальцев.

Параллельный отбор

Подход параллельного отбора (рис. 1 (A)) предполагает, что отдельные домены цинковых пальцев функционально независимы. Исходя из этого, существующие предопределенные области должны использоваться без дополнительного проектирования или выбора, что делает этот метод быстрым и доступным для любой лаборатории.[5][6] Это не всегда верно, так что эта стратегия может иметь проблемы, связанные с перекрытие целевого сайта у ряда целевых последовательностей, как обсуждается позже. При необходимости можно решить проблему перекрытия сайтов-мишеней путем рандомизации аминокислотных остатков на границе двух цинковых пальцев, на которых это происходит.[5]

Последовательный отбор

Последовательный отбор (рис. 1 (B)), предложенный группой Пабо в 1997 году, охватывает кооперативное связывание между цинковыми пальцами с образованием ДНК-связывающих доменов с большим сродством и специфичностью.[7] Как следует из названия, каждый палец выбирается из рандомизированной библиотеки в контексте ранее выбранного пальца. Методы, используемые при отборе, аналогичны методам, описанным ниже, за исключением того, что целевой олигонуклеотид, используемый при отборе, содержит всю целевую последовательность. Как показано на рис. 1, создается библиотека, в которой третий палец содержит рандомизированную альфа-спираль. Домен с лучшими характеристиками связывания выбирается и затем включается в другую библиотеку, в которой удаляется привязка «палец-один», а к противоположному концу добавляется еще один рандомизированный палец. Это продолжается и приводит к ДНК-связывающему домену, в котором все пальцы были выбраны в контексте соседнего пальца, и, поскольку каждый раунд отбора применяется к одной и той же конечной целевой последовательности, перекрытие целевых сайтов все еще происходит, но является преимуществом, а не преимуществом. помеха.

Основным недостатком этого подхода является необходимость создания отдельной библиотеки для каждого цинкового пальца, что превышает возможности большинства лабораторий.

Двудольный отбор

Метод двудольного выбора (рис. 1 (C)) был предложен Isalan et al., 2001.[8] как компромисс между параллельной и последовательной стратегиями отбора. Первые и последние 5 п.н. целевого сайта из 9 п.н. выбирают параллельно и объединяют для получения библиотеки, из которой выбирают последний ZFP.

Чтобы сохранить размер библиотеки в разумных пределах, этот метод ограничивается рандомизацией только ключевых остатков, участвующих в распознавании оснований. Кроме того, в отличие от параллельного отбора, этот метод требует многократного панорамирования, прежде чем можно будет построить новый ZFP.[6]

Выбор цинкового пальца с помощью фагового дисплея

Чтобы определить наиболее подходящую последовательность аминокислот в альфа-спирали цинкового пальца для связывания с данной последовательностью ДНК, можно использовать метод, включающий фаговый дисплей. Изменяя геном выбранного бактериофага, можно создать фаг, который будет отображать ZFP как часть своей белковой оболочки. Такой фаг впоследствии может быть протестирован на адгезию через прикрепленные цинковые пальцы к олигонуклеотиду, содержащему интересующую последовательность, в то время как другой неприлипающий фаг смывается. ДНК внутри фага кодирует экспрессируемые ZFP, поэтому извлечение и секвенирование ДНК связанного фага дает информацию о подходящих конфигурациях аминокислот для связывания конкретной последовательности. Это составляет основу исследования связывания ZFP с помощью фагового дисплея.[9][10]

Работа обычно выполняется с использованием мышиного ZFP-TF. Zif268 или одно из его производных в качестве основы для модификаций последовательности цинкового пальца, поскольку он наиболее хорошо охарактеризован из всех белков цинкового пальца.[3][10] Его производные C7 или же C7.GAT, часто используются из-за их превосходной аффинности и специфичности связывания. C7.GAT использовался для исследования семейств последовательностей 5'-ANN-3 'и 5'-CNN-3', поскольку третий палец C7 определяет гуанин или тимин в 5'-положении последовательности второго пальца (цель перекрытие сайтов).[4][10][11] Нитчатый фаг-помощник и ДНК фага лямбда используются для фагового дисплея. Из-за ограничений в размере библиотек, которые могут быть созданы рутинно, рандомизация может быть ограничена наиболее важными аминокислотами в последовательности ZFP, как это определено Рентгеновская кристаллография. Позиции были идентифицированы как позиции спирали -1, 2, 3, 4, 5 и 6 на первом и третьем пальцах и позиции -2, -1, 1, 2, 3 и 4 на втором пальце в исследовании, опубликованном Wu et al. al. (1995),[10] однако другое исследование Segal et al. (1999)[3] предполагает важность всех положений от -2 до 6 из-за неспецифического сродства некоторых аминокислот и способности других стабилизировать соседние взаимодействия.

Отбор цинковых пальцев in vitro

В качестве мишени используется короткая (~ 34 нт) ДНК шпильки, содержащая сайт связывания ZFP с изменениями, происходящими в одном субсайте. В олигонуклеотид используемый может быть синтезирован с включением первичной n ‑ гексиламиногруппы на его 5'-конце, который позже может быть использован для присоединения бычий сывороточный альбумин (BSA). В этом случае конъюгат используется для предварительного покрытия микротитратора перед нанесением ~ 1013 колониеобразующие единицы фага. После инкубации фаг удаляют и планшет промывают буфером, содержащим 0,5% Подросток 20 для удаления неприлипшего фага.[10] Используя кислотный буфер для элюции, прилипший фаг удаляют и нейтрализуют База Трис.[9] Дальнейшие раунды пэннинга завершаются для обеспечения обогащения образца путем инфицирования бактериальных клеток элюированным фагом и фагом-помощником, а затем сбора [ZFP-отображающего] фага, продуцированного для следующего раунда пэннинга. В качестве альтернативы БСА ДНК-мишень шпильки может быть биотинилированный и позже извлечен с помощью стрептавидин магнитные шарики с покрытием (стрептавидин образует очень прочные связи с биотином).[3]

Для повышения специфичности выбранного фага, особенно в тех случаях, когда исследуются более крупные библиотеки, используются олигонуклеотиды-конкуренты, чтобы изолировать те белки «цинковые пальцы» с меньшей специфичностью перед добавлением биотинилированного целевого олигонуклеотида. ДНК сперматозоидов стриженой сельди, например, будет связывать фаг с неспецифическим сцеплением с ДНК. Последующие раунды пэннинга включают увеличение концентраций специфически синтезированных нецелевых олигонуклеотидов, где все, кроме последовательности целевого субсайта, остаются такими же, вплоть до разницы в один нуклеотид. В частности, целевая последовательность исходного ZFP, которая подверглась мутагенезу, используется в большом количестве для отбора против «родительского фага», загрязняющего библиотеку. Связывание покрытых стрептавидином магнитных шариков можно блокировать с помощью блоттинга и фага, показывающего антитела (нерелевантного), так что связывание происходит только с молекулами с таким высоким сродством, как биотин. Неспецифический фаг удаляют, как и раньше, с использованием буфера, включающего разбавленный твин 20. Связанный фаг собирают с помощью магнитных шариков и могут быть элюированы путем инкубации с трипсин. Таким образом, будут выбраны только те фаги, которые демонстрируют высокоспецифичные ZFP.[3][11]

После элюирования фаг можно высеять на чашки и экстрагировать ДНК из отдельных бляшкообразующих единиц, ограничить и фрагменты подходящего размера экстрагировать после разделения с помощью PAGE. Затем ДНК можно секвенировать, чтобы обнаружить первичную структуру белка, обеспечивающую сцепление с целевой последовательностью. Этот процесс повторяется для каждого из исследуемых подсайтов с одним пальцем 5'-NNN-3 '.

Спроектированные массивы цинковых пальцев

Создание массивов сконструированных Cys2Его2 цинковые пальцы - это наиболее разработанный метод создания белков, способных воздействовать на желаемые последовательности геномной ДНК. Большинство сконструированных массивов цинковых пальцев основано на домене цинковых пальцев мышиного фактора транскрипции Zif268, хотя некоторые группы использовали массивы цинковых пальцев на основе человеческого фактора транскрипции SP1. Zif268 имеет три отдельных мотива «цинковые пальцы», которые вместе связывают последовательность из 9 пар оснований с высокой аффинностью.[12]Структура этого белка, связанного с ДНК, была решена в 1991 г.[13] и стимулировали большое количество исследований в области создания матриц цинковых пальцев. В 1994 и 1995 годах ряд групп использовали фаговый дисплей для изменения специфичности цинкового пальца Zif268.[14][15][16][17]Карлос Ф. Барбас и др. также сообщили о развитии технологии цинковых пальцев в патентной литературе и получили ряд патентов, которые сыграли важную роль в коммерческом развитии технологии цинковых пальцев.[18][19] Типичные сконструированные массивы цинковых пальцев имеют от 3 до 6 отдельных мотивов цинковых пальцев и связывают сайты-мишени в диапазоне от 9 пар оснований до 18 пар оснований в длину. Массивы с 6 мотивами цинковых пальцев особенно привлекательны, потому что они связывают целевой сайт, который достаточно длинный, чтобы иметь хорошие шансы быть уникальным в геноме млекопитающих.[20]В настоящее время существует два основных метода, используемых для создания целых матриц с цинковыми пальцами, модульная сборка и система отбора бактерий, и ведутся споры о том, какой метод лучше всего подходит для большинства приложений.[21][22]

Модульная сборка

Самый простой метод создания новых массивов цинковых пальцев - это объединение меньших «модулей» из цинковых пальцев с известной специфичностью. Структура белка цинкового пальца Zif268, связанного с ДНК, описанная Павлетичем и Пабо в их публикации 1991 г., была ключевой для большей части этой работы и описывает концепцию получения пальцев для каждого из 64 возможных триплетов пар оснований, а затем смешивания и сопоставления этих пальцы для разработки белков с любой желаемой специфичностью последовательности.[13] Самый распространенный процесс модульной сборки включает объединение отдельных цинковых пальцев, каждый из которых может распознавать последовательность ДНК из 3 пар оснований, для создания массивов из 3, 4, 5 или 6 пальцев, которые распознают целевые сайты длиной от 9 пар оснований до 18 пар оснований. . Другой метод использует модули с двумя пальцами для создания массивов цинковых пальцев из шести отдельных цинковых пальцев.[23] Лаборатория Барбаса Исследовательского института Скриппса использовала фаговый дисплей для разработки и характеристики доменов цинковых пальцев, которые распознают большинство последовательностей триплетов ДНК[24][25][26]в то время как другая группа выделила и охарактеризовала отдельные пальцы из генома человека.[27]Потенциальным недостатком модульной сборки в целом является то, что особенности отдельных цинковых пальцев могут перекрываться и могут зависеть от контекста окружающих цинковых пальцев и ДНК. Недавнее исследование продемонстрировало, что большая часть массивов цинковых пальцев с 3 пальцами, генерируемых модульной сборкой, не связывается с намеченной мишенью с достаточной аффинностью в бактериальном двухгибридном анализе и не может функционировать как нуклеазы цинковых пальцев, но вероятность успеха была несколько выше, когда целью были сайты вида GNNGNNGNN.[28] В последующем исследовании использовалась модульная сборка для создания нуклеазы цинковых пальцев как с матрицами с 3 пальцами, так и с матрицами с 4 пальцами, и наблюдал гораздо более высокий уровень успеха с массивами с 4 пальцами.[29] Также сообщалось о варианте модульной сборки, которая учитывает контекст соседних пальцев, и этот метод имеет тенденцию давать белки с улучшенными характеристиками по сравнению со стандартной модульной сборкой.[30]

Методы отбора

Для создания массивов цинковых пальцев, способных нацеливать желаемые последовательности, использовались многочисленные методы отбора. Использованы первоначальные усилия по отбору фаговый дисплей для выбора белков, которые связывают данную мишень ДНК из большого пула частично рандомизированных массивов цинковых пальцев. Эту технику сложно использовать более чем с одним цинковым пальцем одновременно, поэтому были разработаны многоэтапные процессы, которые генерировали полностью оптимизированный массив из трех пальцев путем добавления и оптимизации одного цинкового пальца за раз.[31]В более поздних попытках использовались дрожжевые одногибридные системы, бактериальные одногибридные и двугибридные системы и клетки млекопитающих. Новый многообещающий метод выбора новых матриц цинковых пальцев с 3 пальцами использует бактериальную двухгибридную систему и был назван его создателями «ОТКРЫТЫМ».[32] Эта система объединяет предварительно выбранные пулы отдельных цинковых пальцев, каждый из которых был выбран для связывания данного триплета, а затем использует второй раунд отбора для получения массивов из трех пальцев, способных связывать желаемую последовательность из 9 пар оснований. Эта система была разработана Zinc Finger Consortium в качестве альтернативы коммерческим источникам инженерных матриц цинковых пальцев. Непосредственно сравнивать связывающие свойства белков, полученных с помощью этого метода, с белками, полученными путем модульной сборки, довольно сложно, поскольку профили специфичности белков, полученных с помощью метода OPEN, никогда не сообщались.

Приложения

Сконструированные массивы цинковых пальцев могут затем использоваться во многих приложениях, таких как искусственные факторы транскрипции, метилазы цинковых пальцев, рекомбиназы цинковых пальцев и Нуклеазы цинковых пальцев.[33]В то время как первоначальные исследования с другим ДНК-связывающий домен от бактериального TAL эффекторы показать обещание,[34][35][36][37] еще неизвестно, подходят ли эти домены для некоторых или всех приложений, где в настоящее время используются инженерные цинковые пальцы. Искусственные факторы транскрипции с созданными матрицами цинковых пальцев использовались в многочисленных научных исследованиях, а искусственный фактор транскрипции, который активирует экспрессию VEGF в настоящее время оценивается на людях как потенциальное средство для лечения нескольких клинических показаний. Нуклеазы цинковых пальцев стали полезными реагентами для манипулирования геномами многих высших организмов, включая Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans, табак, кукуруза,[23] данио,[38] различные типы клеток млекопитающих,[39] и крысы.[40] Текущее клиническое исследование оценивает Нуклеазы цинковых пальцев которые разрушают ген CCR5 в CD4 + человеческих Т-клетках в качестве потенциального лечения ВИЧ / СПИД.[41]

Исследование связывающих характеристик

Эти исследования требуют использования растворимых ZFP, поскольку прикрепление к фагу может изменить характеристики связывания цинковых пальцев.[3] После выбора ZFP его последовательность субклонированный из pComb3H в модифицированный вектор бактериальной экспрессии, pMal-c2, связав его с последовательностью, кодирующей белок, связывающий мальтозу. Затем рекомбинант превращается в XL1-синий клетки и экспрессия индуцируется добавлением изопропил-β-D-тиогалактозида (IPTG). Затем экстракты замораживания / оттаивания могут быть очищены для использования в следующих экспериментах. Хотя очистка не является необходимой для многоцелевого ELISA, она важна для измерения аффинности связывания с помощью плазмонного резонанса и следа ДНКазы. Это может быть выполнено с помощью Колонка для FPLC гепарин-сефароза уравновешивают цинковым буфером с последующим подтверждением гомогенности путем Денситометрия геля SDS PAGE[4] Те же методы используются для изучения связывающих свойств завершенной полидактильной химеры ZFP.[42]

Тестирование специфичности

Специфичность ZFP, выбранных с помощью фагового дисплея, проверяется с использованием мультитаргета. иммуноферментный анализ (ELISA). ZFP наносят в лунки для микротитрования, покрытые стрептавидином и биотинилированным целевым олигонуклеотидом. После инкубации лунки промывают, чтобы удалить цинковые пальцы, если они не прилипают к целевой последовательности, с последующим нанесением мышиных антител против MBP (белок, связывающий мальтозу ) антитело и инкубация. Козьи антимышиные антитела, связанные с щелочная фосфатаза добавляется и оставляется для связывания с последующей промывкой для удаления антитела, если оно не связано с цинковыми пальцами. Добавляется субстрат щелочной фосфатазы, и после остановки реакции оптическая плотность при 405 нм (OD405) определяется спектрофотометрия[4]

Показания спектрофотометра зависят от количества щелочной фосфатазы, присутствующей в лунке, которая, в свою очередь, пропорциональна связыванию рассматриваемого ZFP. Если ZFP связывается с последовательностью, для которой он не был выбран со слишком большим сродством, он недостаточно специфичен для большинства медицинских целей и, скорее всего, будет отклонен.

Эти анализы повторяются с использованием различных целевых олигонуклеотидов. Например, при исследовании связывания цинковыми пальцами последовательностей 5'-XNN-3 'необходимо будет исследовать все 16 возможных олигонуклеотидных последовательностей. Далее, чтобы проверить специфичность к 5'-нуклеотиду, полный набор из четырех 5'-ANN-3 ', 5'-CNN-3', 5'-GNN-3 '. Семейства 5'-TNN-3 'используются в качестве мишеней в четырех отдельных реакциях, и относительное связывание в каждой сравнивается.[4]

Кинетический анализ

Кинетический анализ дает информацию как о сродстве, так и о специфичности прикрепления цинкового пальца к цели. Это может быть выполнено с использованием имеющегося в продаже оборудования с использованием поверхностный плазмонный резонанс. Поверхность сенсорного чипа покрыта аффинно очищенным стрептавидином перед нанесением биотинилированных олигонуклеотидов, которые также прилипают к поверхности.[10] Скорость ассоциации (kна) рассчитывается путем измерения скорости связывания ZFP с поверхностью с использованием нескольких различных концентраций белка, в то время как скорость диссоциации (kвыключенный) можно рассчитать, увеличив скорость потока после объединения. Математические вычисления выполняются с помощью программного обеспечения, поставляемого с прибором.[10]

В качестве альтернативы Kd можно рассчитать из анализ сдвига подвижности геля в котором тот же очищенный белок инкубируют с серийными разведениями очищенного в геле, меченного 32P-концом целевого олигонуклеотида. Затем реакции инкубации разрешаются в течение короткого периода времени на полиакриламидный гель и количественный анализ с использованием имеющегося в продаже тепловизора и программного обеспечения. Kd рассчитывается через Анализ Скэтчарда с использованием уравнения изотермы связывания; θб = [пептид] / ([пептид] + Kd).[3][43]

Анализ следа ДНКазы I

Основная статья: Анализ следа ДНКазы I

Чтобы определить пространство, занимаемое ZFP при связывании с его ДНК-мишенью, фрагмент целевого гена амплифицируется с помощью ПЦР и смешивается с фрагментом промотора, меченным 32P-концом. Затем эту реакцию инкубируют с несколькими различными концентрациями ZFP, продуцируемого и очищенного с использованием одного из ранее описанных методов сверхэкспрессии (например, pMal-c2 и XL1-Blue) и методов очистки. Пищеварение с ДНКаза I будут производить фрагменты различной длины, но если ZFP позволили связываться в высокой концентрации, фрагменты соответствующей длины не будут присутствовать в смеси, поскольку активность ДНКазы в этих местах блокируется ZFP. Образцы разделяются на акриламидном (~ 6%) геле мочевины (8 M), используемом для экспонирования пластин фосфорного изображения и записываются на имеющемся в продаже аппарате фосфорного изображения. Программный анализ также может быть использован для получения Kd значения[4]

Перекрытие целевого сайта

Основная статья: Перекрытие целевого сайта

Определенные последовательности аминокислотных остатков способны распознавать и специфичны для расширенного целевого сайта из четырех или даже пяти нуклеотидов.[44] Когда это происходит в ZFP, в котором трехнуклеотидные субсайты являются смежными, один цинковый палец вмешивается в целевой сайт цинкового пальца, прилегающий к нему, ситуация, известная как перекрытие сайтов-мишеней.

Факторы транскрипции белка цинкового пальца

Основная статья: Фактор транскрипции белка цинкового пальца

ZFP-TF, состоящие из активаторов и репрессоров, являются факторы транскрипции состоящий из домена белка цинкового пальца и любого из множества эффекторных доменов фактора транскрипции, которые проявляют свое модулирующее действие вокруг любой последовательности, с которой связывается домен ZFP.

Нуклеазы цинковых пальцев

Основная статья: Нуклеаза цинкового пальца

Нуклеазы цинковых пальцев включают нуклеазный домен, такой как FokI, способные вводить двухцепочечные разрывы в локусе любой последовательности, с которой связывается домен белка цинкового пальца.

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ а б c Гомманс WM, Haisma HJ, Rots MG (2005). «Разработка факторов транскрипции белка цинкового пальца: терапевтическая значимость включения или выключения экспрессии эндогенных генов по команде» (PDF). J. Mol. Биол. 354 (3): 507–19. Дои:10.1016 / j.jmb.2005.06.082. PMID  16253273.
  2. ^ Дурай С., Мани М., Кандавелу К., Ву Дж., Портеус М. Х., Чандрасегаран С. (2005). «Нуклеазы цинковых пальцев: специально разработанные молекулярные ножницы для геномной инженерии клеток растений и млекопитающих». Нуклеиновые кислоты Res. 33 (18): 5978–90. Дои:10.1093 / нар / gki912. ЧВК  1270952. PMID  16251401.
  3. ^ а б c d е ж грамм Сигал DJ, Драйер Б., Бирли Р.Р., Барбас С.Ф. (1999). «На пути к произвольному контролю экспрессии генов: отбор и создание доменов« цинковые пальцы », распознающих каждую из целевых последовательностей ДНК 5'-GNN-3 '». Proc. Natl. Акад. Sci. СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ. 96 (6): 2758–63. Bibcode:1999PNAS ... 96.2758S. Дои:10.1073 / пнас.96.6.2758. ЧВК  15842. PMID  10077584.
  4. ^ а б c d е ж грамм Дрейер Б., Фуллер Р.П., Сигал Д.Д. и др. (2005). «Разработка доменов цинкового пальца для распознавания последовательностей ДНК семейства 5'-CNN-3 'и их использование в создании искусственных факторов транскрипции». J. Biol. Chem. 280 (42): 35588–97. Дои:10.1074 / jbc.M506654200. PMID  16107335.
  5. ^ а б Бирли Р.Р., Барбас К.Ф. (2002). «Инженерные факторы транскрипции полидактильных цинковых пальцев». Nat. Биотехнология. 20 (2): 135–41. Дои:10.1038 / nbt0202-135. PMID  11821858.
  6. ^ а б Уил Т.Г., Хайма Х.Дж., Ротс М.Г. (2003). «Терапевтическая модуляция функции эндогенных генов с помощью агентов с заданной специфичностью последовательности ДНК». Нуклеиновые кислоты Res. 31 (21): 6064–78. Дои:10.1093 / нар / gkg815. ЧВК  275457. PMID  14576293.
  7. ^ Рейнольдс Л., Ульман С., Мур М. и др. (2003). «Репрессия 5 'LTR-промотора ВИЧ-1 и ингибирование репликации ВИЧ-1 с использованием сконструированных факторов транскрипции« цинковые пальцы »». Proc. Natl. Акад. Sci. СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ. 100 (4): 1615–20. Bibcode:2003ПНАС..100.1615Р. Дои:10.1073 / pnas.252770699. ЧВК  149881. PMID  12574502.
  8. ^ Исалан М., Клуг А., Чу Й (2001). «Быстрый, общеприменимый метод создания цинковых пальцев, иллюстрируемый нацеливанием на промотор ВИЧ-1». Nat. Биотехнология. 19 (7): 656–60. Дои:10.1038/90264. ЧВК  2677679. PMID  11433278.
  9. ^ а б Барбас К.Ф., Канг А.С., Лернер Р.А., Бенкович С.Дж. (1991). «Сборка комбинаторных библиотек антител на фаговых поверхностях: сайт гена III». Proc. Natl. Акад. Sci. СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ. 88 (18): 7978–82. Bibcode:1991PNAS ... 88.7978B. Дои:10.1073 / пнас.88.18.7978. ЧВК  52428. PMID  1896445.
  10. ^ а б c d е ж грамм Ву Х, Ян В.П., Барбас С.Ф. (1995). «Создание цинковых пальцев путем селекции: к терапевтическому применению». Proc. Natl. Акад. Sci. СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ. 92 (2): 344–8. Bibcode:1995PNAS ... 92..344Вт. Дои:10.1073 / пнас.92.2.344. ЧВК  42736. PMID  7831288.
  11. ^ а б Драйер Б., Берли Р. Р., Сигал Д. Д., Флиппин Д. Д., Барбас К. Ф. (2001). «Разработка доменов с цинковыми пальцами для распознавания семейства последовательностей ДНК 5'-ANN-3 'и их использование в создании искусственных факторов транскрипции». J. Biol. Chem. 276 (31): 29466–78. Дои:10.1074 / jbc.M102604200. PMID  11340073.
  12. ^ Кристи Б., Натанс Д. (ноябрь 1989 г.). «Сайт связывания ДНК белка, индуцируемого фактором роста Zif268». Proc. Natl. Акад. Sci. СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ. 86 (22): 8737–41. Bibcode:1989PNAS ... 86.8737C. Дои:10.1073 / pnas.86.22.8737. ЧВК  298363. PMID  2510170.
  13. ^ а б Павлетич Н.П., Пабо КО (май 1991 г.). «Распознавание цинкового пальца-ДНК: кристаллическая структура комплекса Zif268-ДНК при 2,1 А». Наука. 252 (5007): 809–17. Bibcode:1991Наука ... 252..809П. Дои:10.1126 / наука.2028256. PMID  2028256.
  14. ^ Rebar EJ, Pabo CO (февраль 1994 г.). «Фаг цинкового пальца: аффинный отбор пальцев с новыми специфичностями связывания ДНК». Наука. 263 (5147): 671–3. Bibcode:1994Наука ... 263..671R. Дои:10.1126 / наука.8303274. PMID  8303274.
  15. ^ Джеймисон А.С., Ким С.Х., Уэллс Дж.А. (май 1994 г.). «Отбор in vitro цинковых пальцев с измененной специфичностью связывания ДНК». Биохимия. 33 (19): 5689–95. Дои:10.1021 / bi00185a004. PMID  8180194.
  16. ^ Choo Y, Klug A (ноябрь 1994 г.). «К коду взаимодействия цинковых пальцев с ДНК: выбор рандомизированных пальцев, отображаемых на фаге». Proc. Natl. Акад. Sci. СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ. 91 (23): 11163–7. Bibcode:1994PNAS ... 9111163C. Дои:10.1073 / пнас.91.23.11163. ЧВК  45187. PMID  7972027.
  17. ^ Ву Х, Ян В.П., Барбас С.Ф. (январь 1995 г.). «Создание цинковых пальцев путем селекции: к терапевтическому применению». Proc. Natl. Акад. Sci. СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ. 92 (2): 344–8. Bibcode:1995PNAS ... 92..344Вт. Дои:10.1073 / пнас.92.2.344. ЧВК  42736. PMID  7831288.
  18. ^ Патенты США 6,140,466,6,140,081; 6 242 568; 6,610,512; 6,790,941; 7,011,972; 7 067 617; 7,101,972; 7,329,541; 7,151,201; 7 329 728; 7 378 510; 7,442,784; 7,741,110; 7,781,645; 7,833,784; Barbas et al. изобретатели
  19. ^ Скотт, Кристофер Томас (2005). «Монополия на нуклеазу цинкового пальца». Природа Биотехнологии. 23 (8): 915–918. Дои:10.1038 / nbt0805-915. PMID  16082353.
  20. ^ Лю Кью, Сигал Диджей, Джиара Дж. Б., Барбас К. Ф. (май 1997 г.). «Дизайн полидактильных белков с цинковыми пальцами для уникальной адресации в сложных геномах». Proc. Natl. Акад. Sci. СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ. 94 (11): 5525–30. Bibcode:1997PNAS ... 94.5525L. Дои:10.1073 / пнас.94.11.5525. ЧВК  20811. PMID  9159105.
  21. ^ Ким Дж. С., Ли Х. Дж., Кэрролл Д. (февраль 2010 г.). «Редактирование генома модульно собранными нуклеазами типа" цинковые пальцы "». Nat. Методы. 7 (2): 91, ответ автора 91–2. Дои:10.1038 / nmeth0210-91a. ЧВК  2987589. PMID  20111032.
  22. ^ Джунг Дж. К., Войтас Д. Ф., Катомен Т. (февраль 2010 г.). "Ответ" на редактирование генома с помощью модульной сборки нуклеаз типа "цинковые пальцы""". Nat. Методы. 7 (2): 91–2. Дои:10.1038 / nmeth0210-91b. ЧВК  2987589.
  23. ^ а б Шукла В.К., Дойон Ю., Миллер Дж. С. и др. (Май 2009 г.). «Точная модификация генома сельскохозяйственных культур Zea mays с использованием нуклеаз типа« цинковые пальцы »». Природа. 459 (7245): 437–41. Bibcode:2009Натура.459..437S. Дои:10.1038 / природа07992. PMID  19404259.
  24. ^ Сегал DJ, Драйер Б., Бирли Р.Р., Барбас С.Ф. (март 1999 г.). «На пути к произвольному контролю экспрессии генов: отбор и конструирование доменов« цинковые пальцы », распознающих каждую из целевых последовательностей ДНК 5'-GNN-3 '». Proc. Natl. Акад. Sci. СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ. 96 (6): 2758–63. Bibcode:1999PNAS ... 96.2758S. Дои:10.1073 / пнас.96.6.2758. ЧВК  15842. PMID  10077584.
  25. ^ Дрейер Б., Фуллер Р.П., Сигал Д.Д. и др. (Октябрь 2005 г.). «Разработка доменов цинкового пальца для распознавания последовательностей ДНК семейства 5'-CNN-3 'и их использование в создании искусственных факторов транскрипции». J. Biol. Chem. 280 (42): 35588–97. Дои:10.1074 / jbc.M506654200. PMID  16107335.
  26. ^ Драйер Б., Бирли Р. Р., Сигал Д. Д., Флиппин Д. Д., Барбас К. Ф. (август 2001 г.). «Разработка доменов с цинковыми пальцами для распознавания семейства последовательностей ДНК 5'-ANN-3 'и их использование в создании искусственных факторов транскрипции». J. Biol. Chem. 276 (31): 29466–78. Дои:10.1074 / jbc.M102604200. PMID  11340073.
  27. ^ Бэ К. Х., Квон Ю. Д., Шин Х. С. и др. (Март 2003 г.). «Человеческие цинковые пальцы как строительные блоки в создании искусственных факторов транскрипции». Nat. Биотехнология. 21 (3): 275–80. Дои:10.1038 / nbt796. PMID  12592413.
  28. ^ C.L. Рамирес; Дж. Э. Фоли; Д.А. Райт; Ф. Мюллер-Лерх; S.H. Рахман; T.I. Корню; Р.Дж. Уинфри; J.D. Sander; F. Fu; J.A. Таунсенд; T. Cathomen; Д.Ф. Войтас; J.K. Чжон (2009). «Неожиданная частота отказов для модульной сборки инженерных цинковых пальцев». Методы природы. 5 (5): 374–375. Дои:10.1038 / nmeth0508-374. PMID  18446154.
  29. ^ Ким Х.Дж., Ли Х.Дж., Ким Х., Чо С.В., Ким Дж.С. (июль 2009 г.). «Целевое редактирование генома в клетках человека с помощью нуклеаз цинковых пальцев, сконструированных посредством модульной сборки». Genome Res. 19 (7): 1279–88. Дои:10.1101 / гр.089417.108. ЧВК  2704428. PMID  19470664.
  30. ^ Сандер Дж. Д., Дальборг Э. Дж., Гудвин М. Дж., Кейд Л., Чжан Ф., Сифуэнтес Д., Куртин С. Дж., Блэкберн Дж. С., Тибодо-Беганни С. и др. (2010). «Конструирование нуклеаз цинкового пальца без отбора путем контекстно-зависимой сборки (CoDA)». Методы природы. 8 (1): 67–69. Дои:10.1038 / nmeth.1542. ЧВК  3018472. PMID  21151135.
  31. ^ Greisman HA, Pabo CO (январь 1997 г.). «Общая стратегия выбора высокоаффинных белков цинкового пальца для различных целевых участков ДНК». Наука. 275 (5300): 657–61. Дои:10.1126 / science.275.5300.657. PMID  9005850.
  32. ^ М.Л. Мэдер; и другие. (Сентябрь 2008 г.). «Быстрая» разработка с открытым исходным кодом индивидуальных нуклеаз цинка на пальцах для высокоэффективной модификации генов ». Мол. Клетка. 31 (2): 294–301. Дои:10.1016 / j.molcel.2008.06.016. ЧВК  2535758. PMID  18657511.
  33. ^ А.С. Джеймисон; Дж. К. Миллер; C.O. Пабо (май 2003 г.). «Открытие лекарств с использованием протеинов с цинковыми пальцами». Обзоры природы Drug Discovery. 2 (5): 361–8. Дои:10.1038 / nrd1087. PMID  12750739.
  34. ^ Москоу MJ, Богданов AJ (декабрь 2009 г.). «Простой шифр управляет распознаванием ДНК эффекторами TAL». Наука. 326 (5959): 1501. Bibcode:2009Научный ... 326.1501M. Дои:10.1126 / science.1178817. PMID  19933106.
  35. ^ Бох Дж., Шольце Х., Шорнак С. и др. (Декабрь 2009 г.). «Нарушение кода специфичности связывания ДНК эффекторов TAL-типа III». Наука. 326 (5959): 1509–12. Bibcode:2009Sci ... 326.1509B. Дои:10.1126 / science.1178811. PMID  19933107.
  36. ^ Кристиан М., Чермак Т., Дойл Э.Л. и др. (Июль 2010 г.). «Эффекторные нуклеазы TAL создают целевые двухцепочечные разрывы ДНК». Генетика. 186 (2): 757–761. Дои:10.1534 / genetics.110.120717. ЧВК  2942870. PMID  20660643.
  37. ^ Ли Т., Хуанг С., Цзян В.З. и др. (Август 2010 г.). «Нуклеазы TAL (TALN): гибридные белки, состоящие из эффекторов TAL и домена расщепления ДНК FokI». Нуклеиновые кислоты Res. 39 (1): 359–372. Дои:10.1093 / nar / gkq704. ЧВК  3017587. PMID  20699274.
  38. ^ С.К. Эккер (2008). «Нокаутирующие удары на основе цинковых пальцев для генов рыбок данио». Данио. 5 (2): 1121–3. Дои:10.1089 / зеб.2008.9988. ЧВК  2849655. PMID  18554175.
  39. ^ Д. Кэрролл (2008). «Прогресс и перспективы: нуклеазы цинковых пальцев как средства генной терапии». Генная терапия. 15 (22): 1463–1468. Дои:10.1038 / gt.2008.145. ЧВК  2747807. PMID  18784746.
  40. ^ Geurts AM, Cost GJ, Freyvert Y, et al. (Июль 2009 г.). «Нокаут крысы с помощью микроинъекции эмбрионов нуклеаз цинкового пальца». Наука. 325 (5939): 433. Bibcode:2009Sci ... 325..433G. Дои:10.1126 / science.1172447. ЧВК  2831805. PMID  19628861.
  41. ^ Тебас, Пабло; и другие. (Февраль 2009 г.). «Аутологичные Т-клетки, генетически модифицированные в гене CCR5 нуклеазами цинковых пальцев SB-728 для ВИЧ (Zinc-Finger)». ClinicalTrials.gov.
  42. ^ Бирли Р.Р., Сигал Д.Д., Драйер Б., Барбас С.Ф. (1998). «На пути к произвольному контролю экспрессии генов: специфическая регуляция промотора erbB-2 / HER-2 с использованием белков полидактильного цинкового пальца, созданных из модульных строительных блоков». Proc. Natl. Акад. Sci. СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ. 95 (25): 14628–33. Bibcode:1998PNAS ... 9514628B. Дои:10.1073 / пнас.95.25.14628. ЧВК  24500. PMID  9843940.
  43. ^ Иманиши М., Ян В., Морисаки Т., Сугиура Ю. (2005). «Искусственный пептид из шести цинковых пальцев с полиаргининовым линкером: селективное связывание с прерывистыми последовательностями ДНК». Biochem. Биофиз. Res. Сообщество. 333 (1): 167–73. Дои:10.1016 / j.bbrc.2005.05.090. PMID  15939400.
  44. ^ Вулф С.А., Грант Р.А., Элрод-Эриксон М., Пабо СО (2001). «Вне« кода распознавания »: структуры двух комплексов цинковый палец / ТАТА-бокс Cys2His2». Структура. 9 (8): 717–23. Дои:10.1016 / S0969-2126 (01) 00632-3. PMID  11587646.