Спектрофотометрия - Spectrophotometry

Настольный спектрофотометр
Спектрофотометр Beckman IR-1, ок. 1941 г.
Спектрофотометр Beckman Model DB (двухлучевая модель), 1960 г.
Портативный спектрофотометр, используемый в полиграфической промышленности.[1]

Спектрофотометрия это филиал электромагнитная спектроскопия связаны с количественным измерением свойств отражения или пропускания материала в зависимости от длины волны.[2] Спектрофотометрия использует фотометры, известные как спектрофотометры, которые могут измерять интенсивность светового луча на разных длинах волн. Хотя спектрофотометрия чаще всего применяется к ультрафиолету, видимый, и инфракрасный излучения, современные спектрофотометры могут исследовать широкий спектр электромагнитный спектр, в том числе Рентгеновский, ультрафиолетовый, видимый, инфракрасный, и / или микроволновая печь длины волн.

Обзор

Спектрофотометрия - это инструмент, который зависит от количественного анализа молекул в зависимости от того, сколько света поглощается окрашенными соединениями. Важными характеристиками спектрофотометров являются спектральная полоса пропускания (диапазон цветов, которые он может передавать через тестовый образец), процент пропускания образца, логарифмический диапазон поглощения образца, а иногда и процент измерения отражательной способности.

Спектрофотометр обычно используется для измерения коэффициента пропускания или отражения растворов, прозрачных или непрозрачных твердых веществ, таких как полированное стекло, или газов. Хотя многие биохимические вещества окрашены, например, они поглощают видимый свет и поэтому могут быть измерены с помощью колориметрических процедур, даже бесцветные биохимические вещества часто можно преобразовать в окрашенные соединения, подходящие для реакций хромогенного окрашивания, с получением соединений, подходящих для колориметрического анализа.[3]:65 Однако они также могут быть разработаны для измерения диффузионность на любом из перечисленных диапазонов света, которые обычно покрывают около 200–2500 нм с использованием различных элементов управления и калибровки.[2] В пределах этих диапазонов освещения необходима калибровка машины с использованием стандартов, которые различаются по типу в зависимости от длина волны из фотометрическое определение.[4]

Примером эксперимента, в котором используется спектрофотометрия, является определение константы равновесия раствора. Определенная химическая реакция в растворе может происходить в прямом и обратном направлении, когда реагенты образуют продукты, а продукты распадаются на реагенты. В какой-то момент эта химическая реакция достигнет точки равновесия, называемой точкой равновесия. Чтобы определить соответствующие концентрации реагентов и продуктов на этом этапе, светопропускание раствора можно проверить с помощью спектрофотометрии. Количество света, проходящего через раствор, указывает на концентрацию определенных химических веществ, которые не пропускают свет.

Поглощение света происходит из-за взаимодействия света с электронными и колебательными модами молекул. Каждый тип молекулы имеет индивидуальный набор энергетических уровней, связанных с составом ее химических связей и ядер, и, таким образом, будет поглощать свет определенной длины волны или энергии, что приводит к уникальным спектральным свойствам.[5] Это основано на его специфическом и отличном составе.

Использование спектрофотометров охватывает различные области науки, такие как физика, материаловедение, химия, биохимия, Химическая инженерия, и молекулярная биология.[6] Они широко используются во многих отраслях промышленности, включая полупроводники, лазерное и оптическое производство, печать и судебно-медицинскую экспертизу, а также в лабораториях для исследования химических веществ. Спектрофотометрия часто используется для измерения активности ферментов, определения концентраций белка, определения ферментативных кинетических констант и измерения реакций связывания лиганда.[3]:65 В конечном итоге спектрофотометр может определить, в зависимости от контроля или калибровки, какие вещества присутствуют в мишени и сколько именно, путем расчетов наблюдаемых длин волн.

В астрономия, термин спектрофотометрия относится к измерение спектра из небесный объект в которой поток шкала спектра откалибрована как функция длина волны, обычно путем сравнения с наблюдением за стандартной спектрофотометрической звездой с поправкой на поглощение света атмосферой Земли.[7]

История

Изобретенный Арнольд О. Бекман в 1940 г.[оспаривается – обсудить]Спектрофотометр был создан с помощью его коллег из его компании National Technical Laboratories, основанной в 1935 году, которая впоследствии стала Beckman Instrument Company и в конечном итоге Бекман Коултер. Это могло бы стать решением для ранее созданных спектрофотометров, которые не могли правильно поглощать ультрафиолет. Он начал с изобретения модели А, в которой стеклянная призма использовалась для поглощения ультрафиолетового света. Было обнаружено, что это не дало удовлетворительных результатов, поэтому в модели B произошел переход от стеклянной к кварцевой призме, что позволило улучшить результаты поглощения. Оттуда родилась Модель C с корректировкой разрешения по длине волны, в результате чего было произведено три ее единицы. Последней и самой популярной моделью стала модель D, которая сейчас более известна как Спектрофотометр ДУ который содержал футляр для инструмента, водородную лампу с ультрафиолетовым излучением и более совершенный монохроматор.[8] Он выпускался с 1941 по 1976 год, тогда как цена на него в 1941 году была АМЕРИКАНСКИЙ ДОЛЛАР$ 723 (аксессуары для дальнего УФ-диапазона были опцией за дополнительную плату). По словам лауреата Нобелевской премии по химии Брюс Меррифилд, это был «вероятно, самый важный инструмент, когда-либо созданный для развития бионауки».[9]

После прекращения производства в 1976 г.[10] Hewlett Packard в 1979 году создал первый коммерчески доступный спектрофотометр с диодной матрицей, известный как HP 8450A.[11] Спектрофотометры с диодной матрицей отличались от оригинального спектрофотометра, созданного Бекманом, потому что это был первый однолучевой спектрофотометр с микропроцессорным управлением, который сканировал несколько длин волн одновременно за секунды. Он облучает образец полихроматическим светом, который образец поглощает в зависимости от его свойств. Затем он передается обратно через решетку матрицы фотодиодов, которая определяет диапазон длин волн спектра.[12] С тех пор создание и внедрение приборов для спектрофотометрии значительно расширилось и стало одним из самых инновационных инструментов нашего времени.

Дизайн

Однолучевой сканирующий спектрофотометр

Существует два основных класса устройств: однолучевые и двухлучевые. Двухлучевой спектрофотометр[13] сравнивает интенсивность света между двумя световыми путями, один из которых содержит эталонный образец, а другой - тестовый. Однолучевой спектрофотометр измеряет относительную силу света луча до и после введения тестового образца. Хотя сравнительные измерения с помощью двухлучевых приборов проще и стабильнее, однолучевые приборы могут иметь больший динамический диапазон, оптически проще и компактнее. Кроме того, некоторые специализированные инструменты, такие как спектрофотометры, встроенные в микроскопы или телескопы, являются однолучевыми инструментами из-за практичности.

Исторически спектрофотометры используют монохроматор содержащий дифракционная решетка для получения аналитического спектра. Решетка может быть подвижной или неподвижной. Если один детектор, такой как фотоумножитель или фотодиод решетку можно сканировать пошагово (сканирующий спектрофотометр), так что детектор может измерять интенсивность света на каждой длине волны (которая будет соответствовать каждому «шагу»). Массивы детекторов (матричный спектрофотометр), например устройства с зарядовой связью (CCD) или фотодиодные матрицы (КПК) также можно использовать. В таких системах решетка является фиксированной, и интенсивность каждой длины волны света измеряется другим детектором в матрице. Кроме того, в большинстве современных спектрофотометров среднего инфракрасного диапазона используется преобразование Фурье метод получения спектральной информации. Эта техника называется Инфракрасная спектроскопия с преобразованием Фурье.

При проведении измерений пропускания спектрофотометр количественно сравнивает долю света, которая проходит через эталонный раствор и тестовый раствор, затем в электронном виде сравнивает интенсивности двух сигналов и вычисляет процент пропускания образца по сравнению с эталонным стандартом. Для измерения коэффициента отражения спектрофотометр количественно сравнивает долю света, отражающуюся от эталонного и тестового образцов. Свет от лампы-источника проходит через монохроматор, который преломляет свет в "радугу" длин волн через вращающуюся призму и выводит узкие полосы этого дифрагированного спектра через механическую щель на выходной стороне монохроматора. Эти значения пропускной способности передаются через тестовый образец. Затем с помощью фотодиода измеряется плотность потока фотонов (обычно ватт на квадратный метр) прошедшего или отраженного света. устройство с зарядовой связью или другой световой датчик. В коэффициент пропускания или отражательная способность Затем значение для каждой длины волны исследуемого образца сравнивается со значениями пропускания или отражения эталонного образца. Большинство приборов применяют логарифмическую функцию к линейному коэффициенту пропускания для расчета «абсорбционной способности» образца, значения, которое пропорционально «концентрации» измеряемого химического вещества.

Вкратце, последовательность событий в сканирующем спектрофотометре следующая:

  1. Источник света светится в монохроматор, дифрагирует в радугу и разделяет на два луча. Затем он просматривается через образец и стандартные растворы.
  2. Части падающих длин волн проходят через образец и эталон или отражаются от них.
  3. Результирующий свет падает на фотоприемник устройство, которое сравнивает относительная интенсивность из двух балок.
  4. Электронные схемы преобразуют относительные токи в проценты линейного пропускания и / или значения поглощения / концентрации.

В матричном спектрофотометре последовательность следующая:[14]

  1. Источник света попадает в образец и фокусируется в щели.
  2. Проходящий свет преломляется в радугу с помощью отражающей решетки.
  3. Полученный свет попадает на фотодетектор, который сравнивает интенсивность луча.
  4. Электронные схемы преобразуют относительные токи в проценты линейного пропускания и / или значения поглощения / концентрации.

Многие старые спектрофотометры необходимо откалибровать с помощью процедуры, известной как «обнуление», чтобы сбалансировать нулевой выходной ток двух лучей на детекторе. Пропускание эталонного вещества устанавливается как базовое (исходное) значение, поэтому пропускание всех других веществ регистрируется относительно исходного «обнуленного» вещества. Затем спектрофотометр преобразует коэффициент пропускания в «впитывающую способность», т.е. концентрацию определенных компонентов исследуемого образца относительно исходного вещества.[6]

Приложения в биохимии

Спектрофотометрия - важный метод, используемый во многих биохимических экспериментах, которые включают выделение ДНК, РНК и белков, кинетику ферментов и биохимические анализы.[15] Поскольку образцы для этих приложений недоступны в больших количествах, они особенно подходят для анализа с помощью этого неразрушающего метода. Кроме того, ценный образец можно сохранить, используя платформу для микрообъемов, где для полного анализа требуется всего 1 мкл образца.[16] Краткое объяснение процедуры спектрофотометрии включает сравнение оптической плотности холостого образца, не содержащего окрашенного соединения, с образцом, содержащим окрашенное соединение. Это окрашивание может быть достигнуто либо с помощью красителя, такого как краситель Coomasie Brilliant Blue G-250, измеренного при 595 нм, либо с помощью ферментативной реакции, наблюдаемой между β-галактозидазой и ONPG (окрашивает образец в желтый цвет) при измерении при 420 нм.[3]:21–119 Спектрофотометр используется для измерения окрашенных соединений в видимой области света (от 350 нм до 800 нм),[3]:65 таким образом, его можно использовать для поиска дополнительной информации об исследуемом веществе. В биохимических экспериментах выбирается химическое и / или физическое свойство, а процедура, которая используется, зависит от этого свойства, чтобы получить дополнительную информацию о образце, такую ​​как количество, чистота, активность фермента и т. Д. Может использоваться спектрофотометрия. для ряда методов, таких как определение оптимального поглощения образцов при длине волны, определение оптимального pH для поглощения образцов, определение концентраций неизвестных образцов и определение pKa различных образцов.[3]:21–119 Спектрофотометрия также является полезным процессом для очистки белка.[17] и также может быть использован в качестве метода для создания оптических анализов соединения. Спектрофотометрические данные также можно использовать в сочетании с уравнением Бера-Ламберта, , чтобы определить различные отношения между коэффициентом пропускания и концентрацией, а также поглощением и концентрацией.[3]:21–119 Поскольку спектрофотометр измеряет длину волны соединения по его цвету, может быть добавлено связывающее краситель вещество, чтобы оно могло измениться в цвете и быть измерено.[18] Можно узнать концентрации двухкомпонентной смеси, используя спектры поглощения стандартных растворов каждого компонента. Для этого необходимо знать коэффициент экстинкции этой смеси на двух длинах волн и коэффициенты экстинкции растворов, содержащих известные веса двух компонентов.[19] Спектрофотометры разрабатывались и совершенствовались на протяжении десятилетий и широко использовались химиками. Кроме того, спектрофотометры специализируются на измерении значений поглощения длины волны УФ или видимого света.[3]:21–119 Он считается высокоточным прибором, который также очень чувствителен и, следовательно, чрезвычайно точен, особенно при определении изменения цвета.[20] Этот метод также удобен для использования в лабораторных экспериментах, поскольку это недорогой и относительно простой процесс.

УФ-видимая спектрофотометрия

Основная статья: Ультрафиолетовая и видимая спектроскопия

Большинство спектрофотометров используются в УФ и видимый области спектра, и некоторые из этих инструментов также работают в близкихинфракрасный регион тоже. Концентрацию белка можно оценить путем измерения OD при 280 нм из-за присутствия триптофана, тирозина и фенилаланина. Этот метод не очень точен, поскольку состав белков сильно различается, а белки, не содержащие ни одной из этих аминокислот, не имеют максимального поглощения при 280 нм. Загрязнение нуклеиновой кислотой также может мешать. Для этого метода требуется спектрофотометр, способный производить измерения в УФ-диапазоне с помощью кварцевых кювет.[3]:135

Ультрафиолетовая-видимая (УФ-видимая) спектроскопия включает уровни энергии, которые вызывают электронные переходы. Поглощение УФ-видимого света возбуждает молекулы, находящиеся в основных состояниях, в их возбужденные состояния.[5]

Спектрофотометрия видимого диапазона 400–700 нм широко используется в колориметрия наука. Это известный факт, что он лучше всего работает в диапазоне 0,2-0,8 OD. Производителям чернил, полиграфическим компаниям, поставщикам текстиля и многим другим нужны данные, полученные с помощью колориметрии. Они снимают показания в районе каждых 5-20 нанометров в видимой области и производят спектральная отражательная способность кривая или поток данных для альтернативных презентаций. Эти кривые можно использовать для тестирования новой партии красителя, чтобы проверить, соответствует ли она спецификациям, например, стандартам печати ISO.

Традиционные спектрофотометры видимой области не могут обнаружить флуоресценцию красителя или основного материала. Это может затруднить решение проблем с цветом, если, например, одна или несколько печатных красок являются флуоресцентными. Если краситель содержит флуоресценцию, биспектральный флуоресцентный спектрофотометр используется. Есть две основные установки для спектрофотометров визуального спектра: d / 8 (сферический) и 0/45. Названия связаны с геометрией источника света, наблюдателя и внутренней части измерительной камеры. Ученые используют этот прибор для измерения количества соединений в образце. Если соединение более концентрированное, образец будет поглощать больше света; в небольших пределах Закон Бера-Ламберта В случае печатных измерений обычно используются две альтернативные настройки - без / с УФ-фильтром, чтобы лучше контролировать влияние УФ-осветлителей на бумагу.

Микрообъемный спектрофотометр МЕТТЛЕР ТОЛЕДО UV5Nano

Образцы обычно готовятся в кюветы; в зависимости от интересующего региона они могут быть построены из стекло, пластик (интересующая область видимого спектра) или кварц (Интересующая область дальнего УФ-спектра). Для некоторых приложений требуются измерения малых объемов, которые можно выполнять с помощью платформ для микрообъемов.

Приложения

Экспериментальное приложение

Как описано в разделе приложений, спектрофотометрия может использоваться как для качественного, так и для количественного анализа ДНК, РНК и белков. Можно использовать качественный анализ и использовать спектрофотометры для регистрации спектров соединений путем сканирования широких диапазонов длин волн для определения оптических свойств (интенсивности цвета) соединения на каждой длине волны.[5] Одним из экспериментов, который может продемонстрировать различные применения видимой спектрофотометрии, является отделение β-галактозидазы от смеси различных белков. В основном спектрофотометрия лучше всего используется для количественной оценки степени очистки, которой подвергся ваш образец, относительно общей концентрации белка. С помощью аффинной хроматографии можно выделить и протестировать B-галактозидазу путем реакции собранных образцов с ONPG и определения того, станет ли образец желтым.[3]:21–119 После этого тестирования образца при 420 нм на специфическое взаимодействие с ONPG и при 595 для анализа Брэдфорда степень очистки можно оценить количественно.[3]:21–119 В дополнение к этой спектрофотометрии можно использовать в тандеме с другими методами, такими как электрофорез SDS-Page, для очистки и выделения различных образцов белка.

ИК-спектрофотометрия

Основная статья: ИК-спектроскопия

Спектрофотометры, предназначенные для инфракрасной области, сильно отличаются из-за технических требований к измерениям в этой области. Одним из основных факторов является тип фотодатчиков, доступных для различных спектральных областей, но инфракрасное измерение также является сложной задачей, потому что практически все излучает ИК-свет в виде теплового излучения, особенно на длинах волн более 5 мкм.

Еще одна сложность заключается в том, что довольно много материалов, таких как стекло и пластик, поглощают инфракрасный свет, что делает его несовместимым с оптической средой. Идеальные оптические материалы соли, которые не сильно впитываются. Образцы для ИК-спектрофотометрии можно размазать между двумя дисками бромид калия или измельчить с бромидом калия и спрессовать в гранулы. Если нужно измерить водные растворы, нерастворимые хлорид серебра используется для построения ячейки.

Спектрорадиометры

Спектрорадиометры, которые работают почти как спектрофотометры видимой области, предназначены для измерения спектральная плотность осветительных приборов. Заявки могут включать оценку и категоризацию освещения для продажи производителем или для подтверждения потребителями лампы, которую они решили приобрести, в соответствии с их спецификациями. Составные части:

  1. Источник света падает на образец или сквозь него.
  2. Образец пропускает или отражает свет.
  3. Детектор определяет, сколько света было отражено от образца или прошло через него.
  4. Затем детектор преобразует количество света, прошедшего или отраженного образца, в число.

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ ISO 12647-2: Графические технологии - Управление процессом производства полутоновых цветоделенных, пробных и промышленных отпечатков - Часть 2: Офсетные литографические процессы. Женева: Международная организация по стандартизации. 2013. с. 13.
  2. ^ а б Allen, DW; Кукси, К; Цай, Б.К. (13 ноября 2009 г.). «Спектрофотометрия». NIST. Получено 23 декабря, 2018.
  3. ^ а б c d е ж грамм час я j Нинфа А.Дж., Баллоу Д.П., Бенор М. (2010). Фундаментальные лабораторные подходы к биохимии и биотехнологии (2-е изд.). Хобокен: Wiley & Sons. ISBN  9780470087664. OCLC  488246403.
  4. ^ Шведт G (1997). Основное руководство по аналитической химии. Перевод Брукса Х. Чичестера, Нью-Йорк: Wiley. С. 16–17. ISBN  9780471974123. OCLC  36543293.
  5. ^ а б c Нинфа А.Дж., Баллоу Д.П. (2004). Фундаментальные лабораторные подходы в биохимии и биотехнологии. Хобокен: Вайли. п. 66. ISBN  9781891786006. OCLC  633862582.
  6. ^ а б Рендина Г (1976). Экспериментальные методы в современной биохимии. Филадельфия, Пенсильвания: Компания W. B. Saunders. стр.46-55. ISBN  0721675506. OCLC  147990.
  7. ^ Oke, J. B .; Ганн, Дж. Э. (1983). «Звезды вторичного стандарта для абсолютной спектрофотометрии». Астрофизический журнал. 266: 713. Bibcode:1983ApJ ... 266..713O. Дои:10.1086/160817.
  8. ^ Ишани, Г. (2006). «Первый коммерческий УФ-видимый спектрофотометр». Ученый. п. 100. Получено 23 декабря, 2018.
  9. ^ Simoni, RD; Hill, RL; Vaughan, M; Табор, H (5 декабря 2003 г.). «Классический прибор: спектрофотометр Beckman DU и его изобретатель, Арнольд О. Бекман». J. Biol. Chem. 278 (49): e1. ISSN  1083-351X.
  10. ^ Beckman, A. O .; Gallaway, W. S .; Kaye, W .; Ульрих, В. Ф. (март 1977 г.). «История спектрофотометрии в Beckman Instruments, Inc.». Аналитическая химия. 49 (3): 280A – 300A. Дои:10.1021 / ac50011a001.
  11. ^ «Hewlett Packard: Идентификация соединений с помощью УФ-видимого спектрофотометра HP 8450 A». Аналитическая химия. 51 (12): 1188A – 1189A. 1979-10-01. Дои:10.1021 / ac50048a728. ISSN  0003-2700.
  12. ^ Нинфа А.Дж., Баллоу Д.П., Бенор М. (2015). Фундаментальные лабораторные подходы к биохимии и биотехнологии (3, ред. Ред.). Хобокен, Нью-Джерси: Wiley & Sons. п. 77. ISBN  9780470924525. OCLC  915641828.
  13. ^ «Полностью автоматический двухлучевой атомно-абсорбционный спектрофотометр (AA 8000)». Лабораторное оборудование. Labindia Analytical Instruments Pvt. ООО
  14. ^ «Применение и основы спектрофотометрии». www.mt.com. Mettler-Toledo International Inc. Получено 4 июля, 2018.
  15. ^ Трамбо, Тони А .; Шульц, Эмерик; Borland, Майкл Дж .; Пью, Майкл Юджин (27 апреля 2013 г.). «Прикладная спектрофотометрия: анализ биохимической смеси». Биохимия и молекулярная биология образование. 41 (4): 242–50. Дои:10.1002 / bmb.20694. PMID  23625877.
  16. ^ «FastTrack ™ UV / VIS Spectroscopy» (PDF). www.mt.com. Mettler-Toledo AG, Analytical. 2016 г.. Получено 23 декабря, 2018.
  17. ^ Cortez, C .; Сепанюк, А .; Гомеш да Силва, Л. (1 мая 2010 г.). "Изучение анимации методов очистки белков как инструментов для преподавания биохимии". Журнал биохимического образования. 8 (2): 12. Дои:10.16923 / reb.v8i2.215.
  18. ^ Гарретт Р.Х., Гришем К.М. (2013). Биохимия. Бельмонт, Калифорния: Cengage. п. 106. ISBN  978-1133106296. OCLC  801650341.
  19. ^ Холидей, Энсор Рослин (27 мая 1936 г.). «Спектрофотометрия белков». Биохимический журнал. 30 (10): 1795–1803. Дои:10.1042 / bj0301795. ЧВК  1263262. PMID  16746224.
  20. ^ Мавродиняну Р., Шульц Дж. И., Менис О., ред. (1973). Точность спектрофотометрических и люминесцентных измерений: Материалы. Вашингтон, округ Колумбия: Национальное бюро стандартов США. п. 2. OCLC  920079.

внешняя ссылка