Аффимер - Affimer

Каркас белка Affimer - показаны две петли и амино-конец, куда могут быть вставлены дизайнерские или случайные пептиды для создания целевой поверхности связывания

Аффимерные молекулы[1] маленькие белки которые связываются с молекулами-мишенями со специфичностью и сродством, подобными антителам.[2][3] Эти сконструированные белки, не связывающие антитела, предназначены для имитировать характеристики молекулярного распознавания моноклональные антитела в разных приложениях.[2][4] Кроме того, эти аффинные реагенты были оптимизированы для повышения их стабильности,[5] сделать их устойчивыми к различным температурам и pH,[6] уменьшить их размер и увеличить их выражение в Кишечная палочка и клетки млекопитающих.[2]

Разработка

Первоначально аффимерные белки были разработаны в Отделение раковых клеток MRC в Кембридже, затем в двух лабораториях Университет Лидса.[7][8][9][10] Получено из цистеиновая протеаза семейство ингибиторов цистатины, которые действуют в природе как ингибиторы цистеиновых протеаз,[11][12] эти 12–14 кДа белки имеют общую третичную структуру альфа-спираль лежа на антипараллельном бета-лист.[13]

Аффимерные белки имеют две пептидные петли и N-концевую последовательность, которые могут быть рандомизированы для связывания с желаемыми белками-мишенями с высоким сродством и специфичностью.[5] аналогично моноклональные антитела. Стабилизация двух пептидов белковым каркасом ограничивает возможные конформации, которые могут принимать пептиды, увеличивая аффинность связывания и специфичность по сравнению с библиотеками свободных пептидов.

Производство

Фаговый дисплей библиотеки из 1010 рандомизированные последовательности потенциальных целевых взаимодействий[14] используются для скрининга белков Affimer, которые проявляют высокоспецифичное связывание с целевым белком с аффинностью связывания в нМ классифицировать.[5][15][16] Умение направлять in vitro методы скрининга позволяют идентифицировать высокоспецифичные связывающие аффимеры с высоким сродством, что исключает требования к созревание аффинности этих реагентов. В пробирке скрининг и разработка также означают, что целевое пространство для связывания Affimer не ограничивается животным-хозяином. иммунная система. Поскольку белки Affimer генерируются с использованием рекомбинантных систем, их создание происходит значительно быстрее и воспроизводимо по сравнению с производством традиционных антитела.[17]

Были созданы мультимерные формы белков Affimer, и было показано, что они дают титриметрические объемы в диапазоне 200–400 мг / л при культивировании в малых масштабах с использованием систем бактериальных хозяев. Предусмотрены мультимерные формы аффимерных белков с одинаковой целевой специфичностью жадность эффекты в связывании мишени, в то время как слияние различных аффимерных белков с разной специфичностью к мишеням позволило бы создать мультиспецифические аффинные белки.[18]

Множество различных тегов и гибридных белков, таких как флуорофоры, одноцепочечная ДНК, His и c-Myc Теги могут быть легко конъюгированы с белками Affimer.[2][19][20][21][22][23] В белок могут быть введены специфические остатки цистеина, чтобы позволить тиоловой химии равномерно ориентировать аффимерные белки на твердой подложке с целью увеличения захвата мишени в анализах связывания лиганда и биосенсорах.[5][15][17][24][25] Эта гибкая функционализация молекулы Affimer максимизирует эффективность реагентов Affimer во многих приложениях и форматах анализа.

Характеристики

Связующие аффимеры представляют собой рекомбинантные белки. Они обладают прочными характеристиками высокой термостабильности с температурами плавления более 80 ° C,[10] устойчивость к экстремальным значениям pH (2–13,7),[10] циклы замораживания-оттаивания и лиофилизация. Низкая молекулярная масса связывающих аффимеров средств означает, что можно избежать проблем стерического затруднения, которые обычно наблюдаются с антителами.[2] Поскольку они производятся с использованием процессов производства рекомбинантных бактерий, для реактивов Affimer сохраняется постоянство от партии к партии, что позволяет преодолеть некоторые проблемы воспроизводимости и надежности поставок.[2][3][17][26][27]

Эти синтетические антитела были разработаны, чтобы быть стабильными, нетоксичными, биологически нейтральными и не содержать посттрансляционных модификаций или дисульфидные мостики.[7][8][10] Две отдельные петлевые последовательности, включающие в общей сложности от 12 до 36 аминокислот, образуют поверхность взаимодействия с мишенью, поэтому поверхности взаимодействия могут варьироваться от 650 до 1000.Å. Предполагается, что большая поверхность взаимодействия приводит к высокоспецифическому связыванию с высоким сродством с белками-мишенями.[5][7][10][15][17][19][28][29][30][31] В результате молекулы Affimer могут различать белки, которые отличаются только одним аминокислота, может обнаруживать незначительные изменения в уровнях экспрессии белка даже в мультиплексированный формат и может различать несколько тесно связанных белковые домены.[2][24][31][32][33]

Приложения

Технология Affimer была коммерциализирована и разработана Avacta, которая разрабатывает эти аффинные реагенты в качестве инструментов для исследований и диагностики, а также в качестве биотерапевтических средств.

Реагенты и диагностика

Связующие аффимеры использовались на нескольких платформах, включая ELISA,[2][17][34] поверхностный плазмонный резонанс,[32][34][35][36] аффинная очистка,[2][34][37] иммуногистохимия[2] и иммуноцитохимия, включая визуализация сверхвысокого разрешения.[2][19][20][21] Аффимерные реагенты, ингибирующие белок-белковые взаимодействия также могут быть получены с потенциалом экспрессии этих ингибиторов в клетках млекопитающих для исследования и модификации сигнальных путей.[2][32][35][38][39] Они также были совместно кристаллизованы в комплексе с целевыми белками,[32][35][40] открытие новых лекарств через in silico скрининг и тесты смещения.[14]

Реагенты Affimer подходят для использования в биосенсорах,[5][15][24][25] диагностика в местах оказания медицинской помощи и в качестве антиидиотипических реагентов в фармакокинетических и терапевтических тестах для мониторинга лекарственных средств.[26][27][31][41][42]

Терапия

Белковый каркас Affimer был разработан как биотерапевтический. Небольшой размер и профиль стабильности белков Affimer в сочетании с их человеческим происхождением придают молекулам Affimer лекарственные свойства. Это может иметь преимущества перед антитела с точки зрения проникновения в ткани, например, в твердых опухоли или для неинвазивных местное введение, например, ингаляционная доставка или нанесение на кожу.[18]

Аффимерные белки можно легко конъюгировать с образованием мультимеров и легко функционализировать для разработки терапевтических средств с конкретными желаемыми характеристиками. Примеры включают производство мультиспецифических молекул аффимеров для нацеливания и рекрутирования определенных клеток, слияние с Fc фрагменты или альбумин связующие, чтобы настроить их период полураспада in vivo и для использования в качестве нацеливающего фрагмента в химерных рецепторах или модифицированного для переноса токсина в конъюгатах Affimer-лекарственное средство.[16][18][43]

Аффимерные терапевтические препараты находятся в стадии открытия и доклинической разработки для решения проблемы нарушения свертываемости крови, устойчивость к антибиотикам, фенотипические модели открытия лекарств и рак, как через CAR-T клеточная терапия и как ингибиторы иммунных контрольных точек.[18][44][45][46] Ранние исследования с использованием ex vivo человеческие образцы показали низкий иммуногенность связанный с каркасом Affimer, на уровнях, сопоставимых с коммерческим терапевтическим антителом.[47] Кроме того, первоначальные доклинические исследования показали хорошую эффективность и переносимость анти-PDL1 иммуно-онкология Терапевтический аффимер у мышей. Ожидается, что IND будет подавать заявку на первое терапевтическое средство Affimer в 2019/2020 гг.[16]

Рекомендации

  1. ^ Фирменное наименование, принадлежит Avacta
  2. ^ а б c d е ж грамм час я j k л Tiede C, Bedford R, Heseltine SJ, Smith G, Wijetunga I, Ross R, et al. (Июнь 2017 г.). «Аффимерные белки - это универсальные и возобновляемые аффинные реагенты». eLife. 6. Дои:10.7554 / elife.24903. ЧВК  5487212. PMID  28654419.
  3. ^ а б Клонт Ф., Хаддеринг М., Хорватович П., Тен Хакен Н.Х., Бишофф Р. (август 2018 г.). «Аффимеры как альтернатива антителам в аффинном ЖХ-МС-анализе для количественной оценки растворимого рецептора конечных продуктов улучшенного гликозилирования (sRAGE) в сыворотке крови человека». Журнал протеомных исследований. 17 (8): 2892–2899. Дои:10.1021 / acs.jproteome.8b00414. ЧВК  6079930. PMID  30005571.
  4. ^ «Альтернативы антителам». Журнал Scientist Magazine®. Получено 2018-10-18.
  5. ^ а б c d е ж Шарма Р., Дикон С.Е., Новак Д., Джордж С.Е., Шимоник М.П., ​​Тан А.А., Томлинсон, округ Колумбия, Дэвис А.Г., Макферсон М.Дж., Валти С. (июнь 2016 г.). "Биосенсор электрохимического импеданса без этикеток для обнаружения человеческого интерлейкина-8 в сыворотке с чувствительностью ниже пг / мл". Биосенсоры и биоэлектроника. 80: 607–613. Дои:10.1016 / j.bios.2016.02.028. ЧВК  4785862. PMID  26897263.
  6. ^ Роулингс А.Э., Брамбл Дж. П., Тан А.А., Сомнер Л.А., Моннингтон А.Э., Кук Д.И., Макферсон М.Дж., Томлинсон округ Колумбия, Станиленд СС (октябрь 2015 г.). «Фаговый дисплей выбрал магнетит, взаимодействующий с адиронами, для синтеза наночастиц с контролируемой формой». Химическая наука. 6 (10): 5586–5594. Дои:10.1039 / C5SC01472G. ЧВК  5949846. PMID  29861896.
  7. ^ а б c Вудман Р., Йе Дж. Т., Лоренсон С., Ко Ферриньо П. (октябрь 2005 г.). «Дизайн и проверка нейтрального белкового каркаса для презентации пептидных аптамеров». Журнал молекулярной биологии. 352 (5): 1118–33. Дои:10.1016 / j.jmb.2005.08.001. PMID  16139842.
  8. ^ а б Хоффманн Т., Стадлер Л.К., Басби М., Сонг К., Бакстон А.Т., Вагнер С.Д., Дэвис Дж. Дж., Ко Ферриньо П. (май 2010 г.). «Структурно-функциональные исследования сконструированного каркасного белка, полученного из стефина A. I: Разработка варианта SQM». Белковая инженерия, дизайн и выбор. 23 (5): 403–13. Дои:10.1093 / белок / gzq012. ЧВК  2851446. PMID  20179045.
  9. ^ Стадлер Л.К., Хоффманн Т., Томлинсон Д.К., Сонг Кью, Ли Т., Басби М., Ньяти И., Гендра Э, Тид Си, Фланаган К., Кокелл С.Дж., Випат А., Харвуд К., Вагнер С.Д., Ноулз М.А., Дэвис Дж. Дж., Киган Н. , Ферриньо П.К. (сентябрь 2011 г.). «Структурно-функциональные исследования сконструированного каркасного белка, полученного из Стефина А. II: Разработка и применение варианта SQT». Белковая инженерия, дизайн и выбор. 24 (9): 751–63. Дои:10.1093 / белок / gzr019. PMID  21616931.
  10. ^ а б c d е Тид С, Тан А.А., Дикон С.Е., Мандал Ю., Неттлшип Дж. Э., Оуэн Р.Л., Джордж С.Е., Харрисон Д.Дж., Оуэнс Р.Дж., Томлинсон округ Колумбия, Макферсон М.Дж. (май 2014 г.). «Adhiron: стабильный и универсальный каркас пептидного дисплея для приложений молекулярного распознавания». Белковая инженерия, дизайн и выбор. 27 (5): 145–55. Дои:10.1093 / белок / gzu007. ЧВК  4000234. PMID  24668773.
  11. ^ Turk V, Stoka V, Turk D (май 2008 г.). «Цистатины: биохимические и структурные свойства и медицинское значение». Границы биологических наук. 13 (13): 5406–20. Дои:10.2741/3089. PMID  18508595.
  12. ^ Кондо Х., Абе К., Эмори Й., Араи С. (январь 1991 г.). «Генная организация оризацистатина-II, нового члена надсемейства цистатина растительного происхождения, тесно связана с организацией оризацистатина-I, но отличается от таковой у цистатинов животных». Письма FEBS. 278 (1): 87–90. Дои:10.1016 / 0014-5793 (91) 80090-п. PMID  1993479.
  13. ^ Turk V, Bode W (июль 1991 г.). «Цистатины: белковые ингибиторы цистеиновых протеиназ». Письма FEBS. 285 (2): 213–9. Дои:10.1016 / 0014-5793 (91) 80804-C. PMID  1855589.
  14. ^ а б Аррата I, Барнард А., Томлинсон округ Колумбия, Уилсон А.Дж. (март 2017 г.). «Взаимодействие нативных и ненативных пептидов: использование аффимеров для распознавания α-спирали, имитирующей фолдамеры» (PDF). Химические коммуникации. 53 (19): 2834–2837. Дои:10.1039 / c6cc09395g. PMID  28217789.
  15. ^ а б c d Жураский П., Арья С.К., Джолли П., Тиде С., Томлинсон, округ Колумбия, Ко Ферриньо П., Эстрела П. (июнь 2018 г.). «Чувствительный и селективный емкостный биосенсор на основе встречно-штыревого электрода, функционализированный аффимером, для обнаружения опухолевых биомаркеров белка Her4» (PDF). Биосенсоры и биоэлектроника. 108: 1–8. Дои:10.1016 / j.bios.2018.02.041. PMID  29482002.
  16. ^ а б c Басран А, Стэнли Э (01.07.2018). "Abstract 3776: Создание и форматирование биотерапевтического препарата Affimer® для ингибирования пути PD-L1 / PD-1: Подтверждение концепции на мыши". Исследования рака. 78 (13 приложение): 3776. Дои:10.1158 / 1538-7445.AM2018-3776. ISSN  0008-5472.
  17. ^ а б c d е Xie C, Tiede C, Zhang X, Wang C, Li Z, Xu X, McPherson MJ, Tomlinson DC, Xu W. (август 2017 г.). «Разработка комбинированного иммунологического диагностического набора аффимер-антитело для глипикана-3». Научные отчеты. 7 (1): 9608. Дои:10.1038 / с41598-017-10083-в. ЧВК  5575301. PMID  28852111.
  18. ^ а б c d «Интервью с Амриком Басраном в Avacta Life Sciences». Обзор лекарственной мишени.
  19. ^ а б c Schlichthaerle T, Eklund AS, Schueder F, Strauss MT, Tiede C, Curd A, Ries J, Peckham M, Tomlinson DC, Jungmann R (август 2018 г.). «Сайт-специфическая маркировка аффимеров для микроскопии DNA-PAINT» (PDF). Angewandte Chemie. 57 (34): 11060–11063. Дои:10.1002 / anie.201804020. PMID  29873161.
  20. ^ а б Бедфорд Р., Тид С., Хьюз Р., Творог А., Макферсон М.Дж., Пекхэм М., Томлинсон, округ Колумбия (август 2017 г.). «Альтернативные реагенты антителам для визуализации». Биофизические обзоры. 9 (4): 299–308. Дои:10.1007 / s12551-017-0278-2. ЧВК  5578921. PMID  28752365.
  21. ^ а б Лопата А., Хьюз Р., Тид С., Хейсслер С. М., Селлерс-младший, Найт П. Дж., Томлинсон Д., Пекхэм М. (апрель 2018 г.). «Аффимерные белки для F-актина: новые аффинные реагенты, которые маркируют F-актин в живых и фиксированных клетках». Научные отчеты. 8 (1): 6572. Дои:10.1038 / s41598-018-24953-4. ЧВК  5920084. PMID  29700342.
  22. ^ Wang W, Guo Y, Tiede C, Chen S, Kopytynski M, Kong Y, Kulak A, Tomlinson D, Chen R, McPherson M, Zhou D (май 2017 г.). «Ультраэффективный протокол обмена капсулами для компактных биофункциональных квантовых точек для чувствительного ратиометрического биосенсинга и визуализации клеток». Прикладные материалы и интерфейсы ACS. 9 (18): 15232–15244. Дои:10.1021 / acsami.6b13807. ЧВК  5432960. PMID  28421739.
  23. ^ Фишер MJ, Williamson DJ, Burslem GM, Plante JP, Manfield IW, Tiede C, Ault JR, Stockley PG, Plein S, Maqbool A, Tomlinson DC, Foster R, Warriner SL, Bon RS (декабрь 2015 г.). «Трехвалентные реактивы Gd-DOTA для модификации белков». RSC Advances. 5 (116): 96194–96200. Дои:10.1039 / c5ra20359g. ЧВК  4786947. PMID  27019702.
  24. ^ а б c Weckman NE, McRae C, Ko Ferrigno P, Seshia AA (октябрь 2016 г.). «Сравнение специфичности и аффинности связующих Affimer с иммобилизованной поверхностью с использованием микровесов с кристаллами кварца». Аналитик. 141 (22): 6278–6286. Дои:10.1039 / c6an01602b. PMID  27704086.
  25. ^ а б Кутсумпели Э, Тид С, Мюррей Дж, Тан А, Бон RS, Томлинсон, округ Колумбия, Джонсон С. (март 2017 г.). «Миметики антител для обнаружения небольших органических соединений с использованием кварцевых микровесов». Аналитическая химия. 89 (5): 3051–3058. Дои:10.1021 / acs.analchem.6b04790. PMID  28192970.
  26. ^ а б «Антиидиотипические связывающие вещества для трастузумаба, подтвержденные в ходе регуляторного биоанализа в сотрудничестве с Covance». Avacta. Получено 2018-10-19.
  27. ^ а б «Разработка и проверка антиидиотипических аффмеров трастузумаба в фармакокинетическом анализе | Avacta». www.avacta.com. Получено 2018-10-19.
  28. ^ Дэвис Дж. Дж., Ткач Дж, Лоренсон С., Ко Ферриньо П. (февраль 2007 г.). «Пептидные аптамеры в детектировании белков без метки: 1. Характеристика иммобилизованного каркаса». Аналитическая химия. 79 (3): 1089–96. Дои:10.1021 / ac061863z. PMID  17263340.
  29. ^ Дэвис Дж. Дж., Ткач Дж., Хамфрис Р., Бакстон А. Т., Ли Т. А., Ко Ферриньо П. (май 2009 г.). «Пептидные аптамеры в обнаружении белков без метки: 2. Химическая оптимизация и обнаружение отдельных изоформ белка». Аналитическая химия. 81 (9): 3314–20. Дои:10.1021 / ac802513n. PMID  19320493.
  30. ^ «Связывающие аффимеры улучшают эффективность диагностического анализа для обнаружения C.difficile». Avacta. Получено 2018-10-19.
  31. ^ а б c «Разработка и характеристика аффимеров, связывающих 4 ведущих терапевтических антитела | Avacta». www.avacta.com. Получено 2018-10-19.
  32. ^ а б c d Робинсон Д.И., Бакстер Е.В., Оуэн Р.Л., Томсен М., Томлинсон, округ Колумбия, Член парламента Уотерхауса, Вин С.Дж., Неттлшип Дж.Э., Тид С, Фостер Р.Дж., Оуэнс Р.Дж., Фишвик С.В., Харрис С.А., Голдман А., Макферсон М.Дж., Морган А.В. (январь 2018 г. ). «Аффимерные белки ингибируют связывание иммунного комплекса с FcγRIIIa с высокой специфичностью за счет конкурентных и аллостерических способов действия». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 115 (1): E72 – E81. Дои:10.1073 / pnas.1707856115. ЧВК  5776790. PMID  29247053.
  33. ^ Эванс Д., Джонсон С., Лоренсон С., Дэвис А.Г., Ко Ферриньо П., Вэлти С. (2008). «Электрическое обнаружение белков в клеточных лизатах с использованием микрочипов пептид-аптамер высокой плотности». Журнал биологии. 7 (1): 3. Дои:10.1186 / jbiol62. ЧВК  2246035. PMID  18237447.
  34. ^ а б c "Ученый Avacta доктор Джефф Платт представляет данные Affimer на веб-семинаре | Avacta". www.avacta.com. Получено 2018-10-22.
  35. ^ а б c Мишель М.А., Сватек К.Н., Хоспенталь М.К., Командер Д. (октябрь 2017 г.). «Аффимеры, специфичные для связывания убиквитина, раскрывают понимание передачи сигналов убиквитина, связанного с K6». Молекулярная клетка. 68 (1): 233–246.e5. Дои:10.1016 / j.molcel.2017.08.020. ЧВК  5640506. PMID  28943312.
  36. ^ Джонсон А., Сонг В., Ко Ферриньо П., Буэно ПР, Дэвис Дж. Дж. (Август 2012 г.). «Чувствительный аффимер и импедиметрические тесты без метки на основе антител для С-реактивного белка». Аналитическая химия. 84 (15): 6553–60. Дои:10.1021 / ac300835b. PMID  22789061.
  37. ^ «Реагенты Affimer® облегчают очистку с помощью аффинной хроматографии». www.drugtargetreview.com. Получено 2018-10-22.
  38. ^ Кайл Х.Ф., Уиксон К.Ф., Стотт Дж., Бурслем GM, Бриз А.Л., Тид С., Томлинсон, округ Колумбия, Уорринер С.Л., Нельсон А., Уилсон А.Дж., Эдвардс Т.А. (октябрь 2015 г.). «Исследование интерфейса HIF-1α / p300 с использованием пептидов и технологий фагового дисплея Adhiron». Молекулярные биосистемы. 11 (10): 2738–49. Дои:10.1039 / c5mb00284b. PMID  26135796.
  39. ^ Heidelberger JB, Voigt A, Borisova ME, Petrosino G, Ruf S, Wagner SA, Beli P (апрель 2018 г.). «Протеомное профилирование субстратов VCP связывает VCP с K6-связанным убиквитилированием и функцией c-Myc». Отчеты EMBO. 19 (4): e44754. Дои:10.15252 / набр.201744754. ЧВК  5891417. PMID  29467282.
  40. ^ Герш М., Гладкова С., Шуберт А.Ф., Мишель М.А., Маслен С., Командер Д. (ноябрь 2017 г.). «Механизм и регуляция Lys6-селективной деубиквитиназы USP30». Структурная и молекулярная биология природы. 24 (11): 920–930. Дои:10.1038 / nsmb.3475. ЧВК  5757785. PMID  28945249.
  41. ^ «Covance проверяет аффимеры как критические реагенты для анализа PK». Avacta. Получено 2018-10-22.
  42. ^ "Веб-семинар: Специфичность мультиплексирования и перекрестная реактивность между видами в открытии биологических препаратов (по запросу) - Intellicyt". Intellicyt. Получено 2018-10-22.
  43. ^ «Конъюгаты аффимерных лекарственных средств TMAC». Avacta. Получено 2018-10-22.
  44. ^ Маллиган, Том. «Avacta и онкологический центр Memorial Sloan Kettering в сотрудничестве с исследователями клеточной терапии». Получено 2018-10-22.
  45. ^ «Трубопровод | Авакта». www.avacta.com. Получено 2018-10-22.
  46. ^ Король Р., Тид С., Симмонс К., Фишвик С., Томлинсон Д., Аджан Р. (февраль 2015 г.). «Ингибирование взаимодействия комплемента C3 и фибриногена: потенциальная новая терапевтическая мишень для уменьшения сердечно-сосудистых заболеваний при диабете». Ланцет. 385 Приложение 1: S57. Дои:10.1016 / с0140-6736 (15) 60372-5. PMID  26312879.
  47. ^ «Аффимерная технология: результаты тестирования на иммуногенность PBMC». Avacta. Получено 2018-10-22.

внешняя ссылка