Сине-белый экран - Blue–white screen

Чашка с агаром LB показывает результат бело-синего экрана.

В сине-белый экран это метод проверки что позволяет быстро и удобно обнаруживать рекомбинантные бактерии в вектор -основан молекулярное клонирование эксперименты. ДНК представляющий интерес, привязан к вектор. Тогда вектор вставлен в компетентная клетка-хозяин жизнеспособные для трансформации, которые затем выращивают в присутствии X-gal. Клетки трансформированы векторами, содержащими рекомбинантная ДНК будут производить белые колонии; клетки, трансформированные нерекомбинантными плазмидами (т.е. только вектором), превращаются в синие колонии. Этот метод скрининга обычно выполняется с использованием подходящего бактериальный штамм, но также могут использоваться другие организмы, такие как дрожжи.

Фон

Молекулярное клонирование это одна из наиболее часто используемых процедур в молекулярная биология. Представляющий интерес ген может быть вставлен в плазмидный вектор посредством перевязка, и плазмида затем превращается в кишечная палочка клетки. Однако не все плазмиды, трансформированные в клетки, могут содержать желаемую генную вставку, и проверка каждой отдельной колонии на наличие вставки занимает много времени. Таким образом, метод обнаружения вставки был бы полезен, чтобы сделать эту процедуру менее трудоемкой и трудоемкой. Одним из первых методов, разработанных для обнаружения вставки, является сине-белый скрининг, который позволяет идентифицировать успешные продукты реакций клонирования по цвету бактериальный колония.

Метод основан на принципе α-дополнения β-галактозидаза ген. Этот феномен α-комплементации был впервые продемонстрирован в работе, выполненной Агнес Ульманн в лаборатории Франсуа Жакоб и Жак Моно, где было показано, что функция неактивной мутантной β-галактозидазы с удаленной последовательностью восстанавливается фрагментом β-галактозидазы, в котором та же самая последовательность, α-донорный пептид, все еще не повреждена.[1] Лэнгли и другие. показали, что мутант нефункциональный β-галактозидаза часть его N-конца отсутствовала с удаленными остатками 11-41, но он может быть дополнен пептидом, образованным остатками 3-90 β-галактозидазы.[2] Нитчатый фаг M13 содержащая последовательность, кодирующая первые 145 аминокислот, была позже сконструирована Мессинг и др.и α-комплементация с использованием вектора была продемонстрирована образованием синих бляшек, когда клетки, содержащие неактивный белок, были инфицированы фагом и затем выращены в планшетах, содержащих X-gal.[3]

Серия плазмиды pUC клонирование векторов Виейра и Мессинг были разработаны на основе системы M13 и были первыми плазмидами, сконструированными с использованием преимуществ этого метода скрининга.[4] В этом методе ДНК, лигированная в плазмиду, разрушает α-пептид и, следовательно, процесс комплементации, и не может образоваться функциональная β-галактозидаза. Таким образом, клетки, трансформированные плазмидой, содержащей вставку, образуют белые колонии, а клетки, трансформированные плазмидой без вставки, образуют синие колонии; Таким образом, результат успешной перевязки можно легко определить по белой окраске клеток, образовавшихся из неудачных синих.[5]

Молекулярный механизм

Схематическое изображение сине-белого анализа, используемого для скрининга рекомбинантных векторов

β-галактозидаза белок, кодируемый lacZ ген лак оперон, и существует как гомотетрамер в активном состоянии. Однако мутантная β-галактозидаза, полученная из штамма M15 штамма Кишечная палочка имеет удаленные N-концевые остатки 11-41, и этот мутант, ω-пептид, не может образовывать тетрамер и неактивен. Однако эта мутантная форма белка может полностью вернуться в свое активное тетрамерное состояние в присутствии N-концевого фрагмента белка, α-пептида. Восстановление функции мутантной β-галактозидазы α-пептидом называется α-комплементацией.

В этом методе скрининга хост Кишечная палочка напряжение несет в себе lacZ делеционный мутант (lacZΔM15), который содержит ω-пептид, а используемые плазмиды несут lacZα последовательность, которая кодирует первые 59 остатков β-галактозидазы, α-пептида. Ни один из них не работает сам по себе. Однако, когда два пептида экспрессируются вместе, например, когда плазмида, содержащая lacZα последовательность преобразуется в lacZΔM15 клетки, они образуют функциональную β-галактозидаза фермент.

Метод сине-белого скрининга работает, нарушая этот процесс α-дополнения. Плазмида несет внутри lacZα последовательность внутреннего сайт множественного клонирования (MCS). Эта MCS в рамках lacZα последовательность может быть разрезана рестрикционными ферментами, так что чужеродная ДНК может быть вставлена ​​в lacZα-ген, тем самым разрушая ген, продуцирующий α-пептид. Следовательно, в клетках, содержащих плазмиду со вставкой, нет функциональной β-галактозидаза могут быть сформированы.

Присутствие активной β-галактозидазы можно определить с помощью X-gal, бесцветный аналог лактозы, которая может расщепляться β-галактозидазой с образованием 5-бром-4-хлориндоксила, который затем спонтанно димеризуется и окисляется с образованием ярко-синего нерастворимого пигмента 5,5'-дибром-4,4'-дихлор-индиго . Это приводит к характерному синему цвету в клетках, содержащих функциональную β-галактозидазу. Таким образом, синие колонии показывают, что они могут содержать вектор с непрерывным lacZα (поэтому вставка отсутствует), в то время как белые колонии, где X-gal не гидролизуется, указывают на присутствие вставки в lacZα который нарушает образование активной β-галактозидазы.

Рекомбинантные клоны могут быть дополнительно проанализированы путем выделения и очистки небольших количеств плазмидной ДНК из трансформированных колоний, и рестрикционные ферменты могут быть использованы для разрезания клона и определения, есть ли в нем интересующий фрагмент.[6] Если ДНК необходимо секвенировать, плазмиды из колоний необходимо будет выделить в определенный момент, будь то разрезание с использованием рестрикционных ферментов или выполнение других анализов.

Практические соображения

Правильный тип вектор и компетентные клетки являются важными соображениями при планировании сине-белого экрана. Плазмида должна содержать lacZα, и примерами таких плазмид являются pUC19 и pBluescript. В Кишечная палочка ячейка должна содержать мутант lacZ ген с удаленной последовательностью (т.е. lacZΔM15), и некоторые из обычно используемых клеток с таким генотипом - это JM109, DH5α и XL1-Blue.

Также следует понимать, что на lac-оперон влияет присутствие глюкозы. Протеин EIIAGlc, который участвует в импорте глюкозы, отключает пермеазу лактозы, когда глюкоза транспортируется в клетку. Поэтому среда, используемая в чашке с агаром, не должна включать глюкозу.

X-gal чувствителен к свету, поэтому его раствор и планшеты, содержащие X-gal, следует хранить в темноте. Изопропил β-D-1-тиогалактопиранозид (IPTG), который действует как индуктор лак оперон, можно использовать в среде для усиления экспрессии LacZ.

X-gal это дорогой материал, поэтому были разработаны другие методы для выявления бактерий. GFP был разработан как альтернатива для выявления бактерий. Эта концепция аналогична α-комплементации, при которой вставка ДНК может нарушить кодирующую последовательность в векторе и, таким образом, нарушить продукцию GFP, что приведет к образованию нефлуоресцирующих бактерий.[7] Бактерии, которые имеют рекомбинантные векторы (вектор + вставка), будут белыми и не будут экспрессировать белок GFP, в то время как нерекомбинантные (вектор) будут флуоресцировать в УФ-свете.

GFP в целом использовался в качестве репортерного гена, с помощью которого люди могут окончательно определить, несет ли клон ген, анализируемый исследователями. Иногда среда, в которой растут колонии, может влиять на экран и давать ложноположительные результаты.[8] X-gal в среде может иногда разлагаться, давая синий цвет, или GFP может терять свою флуоресценцию из-за среды и может повлиять на возможности исследователей определять колонии с желаемыми рекомбинантными и те, которые им не обладают.[9]

Недостатки

Некоторые белые колонии могут не содержать желаемой рекомбинантной плазмиды по ряду причин. Лигированная ДНК может быть неправильной или неправильно лигирована, и возможно, что некоторый линеаризованный вектор будет трансформирован, его концы «отремонтированы» и лигированы вместе, так что не образуется LacZα и не могут образовываться синие колонии. Мутация также может привести к неэкспрессии α-фрагмента. Колония без переносчика вообще будет также выглядеть белой и иногда может появляться как колония-спутник после антибиотик использованный был истощен. Также возможно, что синие колонии могут содержать вставку. Это происходит, когда вставка находится «в рамке» с геном LacZα, а кодон STOP во вставке отсутствует. Это может привести к экспрессии слитого белка, который имеет функциональный LacZα, если его структура не нарушена. Правильная рекомбинантная конструкция может иногда давать более светлые синие колонии, что может затруднить ее идентификацию.

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ Ullmann, A .; Джейкоб, Ф .; Моно, Дж. (1967). «Характеристика путем комплементации in vitro пептида, соответствующего проксимальному к оператору сегменту структурного гена бета-галактозидазы Escherichia coli». Журнал молекулярной биологии. 24 (2): 339–343. Дои:10.1016/0022-2836(67)90341-5. PMID  5339877.
  2. ^ Langley, K. E .; Villarejo, M. R .; Fowler, A. V .; Zamenhof, P.J .; Забин И. (1975). «Молекулярная основа альфа-комплементации бета-галактозидазы». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 72 (4): 1254–1257. Дои:10.1073 / пнас.72.4.1254. ЧВК  432510. PMID  1093175.
  3. ^ Messing, J .; Gronenborn, B .; Müller-Hill, B .; Ганс Хопшнайдер, П. (1977). «Нитчатый колифаг M13 в качестве носителя для клонирования: вставка фрагмента HindII регуляторной области lac в репликативную форму M13 in vitro». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 74 (9): 3642–3646. Bibcode:1977ПНАС ... 74.3642М. Дои:10.1073 / pnas.74.9.3642. ЧВК  431673. PMID  333444.
  4. ^ Vieira, J .; Мессинг, Дж. (1982). «Плазмиды pUC, производная от M13mp7 система для инсерционного мутагенеза и секвенирования с синтетическими универсальными праймерами». Ген. 19 (3): 259–268. Дои:10.1016/0378-1119(82)90015-4. PMID  6295879.
  5. ^ Джозеф Сэмбрук, Дэвид Рассел. "Глава 1". Молекулярное клонирование - лабораторное руководство. 1 (3-е изд.). п. 1.27. ISBN  978-0-87969-577-4.
  6. ^ Дж., Нинфа, Александр (1998). Фундаментальные лабораторные подходы в биохимии и биотехнологии. Баллоу, Дэвид П. Бетесда, Мэриленд: Fitzgerald Science Press. С. 355–356. ISBN  1891786008. OCLC  38325074.
  7. ^ Speltz, Элизабет Б .; Риган, Линн (июнь 2013 г.). «Белый и зеленый скрининг с круговым клонированием полимеразного расширения для простого и надежного клонирования». Белковая наука. 22 (6): 859–864. Дои:10.1002 / pro.2268. ЧВК  3690724. PMID  23592493.
  8. ^ Банерджи, Сампали; Кумар, Джитендра; Апте-Дешпанде, Анджали; Падманабхан, Шрирам (11 мая 2010 г.). «Новый прокариотический вектор для идентификации и отбора рекомбинантов: прямое использование вектора для исследования экспрессии в E. coli». Фабрики микробных клеток. 9: 30. Дои:10.1186/1475-2859-9-30. ISSN  1475-2859. ЧВК  2882348. PMID  20459760.
  9. ^ Банерджи, Сампали; Кумар, Джитендра; Апте-Дешпанде, Анджали; Падманабхан, Шрирам (11 мая 2010 г.). «Новый прокариотический вектор для идентификации и отбора рекомбинантов: прямое использование вектора для исследования экспрессии в E. coli». Фабрики микробных клеток. 9: 30. Дои:10.1186/1475-2859-9-30. ISSN  1475-2859. ЧВК  2882348. PMID  20459760.