CRISPR вмешательство - CRISPR interference

Транскрипционная репрессия через стерические препятствия

CRISPR вмешательство (CRISPRi) - это метод генетического возмущения, который позволяет репрессию экспрессии генов в зависимости от последовательности прокариотический и эукариотический клетки. Впервые он был разработан Стэнли Ци и коллеги в лабораториях Венделл Лим, Адам Аркин, Джонатан Вайсман, и Дженнифер Дудна.[1] Последовательно-специфическая активация экспрессии гена относится к Активация CRISPR (CRISPRa).

На основе бактериальной генетической иммунной системы - CRISPR (сгруппированные через регулярные промежутки короткие палиндромные повторы) путь,[2] методика обеспечивает дополнительный подход к РНК-интерференция. Однако разница между CRISPRi и RNAi заключается в том, что CRISPRi регулирует экспрессию генов в первую очередь на уровне транскрипции, тогда как RNAi контролирует гены на уровне мРНК.

Фон

Смотрите также: CRISPR и Редактирование генов CRISPR

Много бактерии и большинство археи имеют адаптивную иммунную систему, которая включает гены CRISPR РНК (crRNA) и CRISPR-ассоциированные (cas).

Методика CRISPR-интерференции (CRISPRi) была впервые описана Лей С. Ци и исследователями из Калифорнийский университет в Сан-Франциско в начале 2013 года.[1] В технологии используется каталитически мертвый Cas9 (обычно обозначаемый как dCas9) белок, не обладающий эндонуклеазной активностью для регуляции генов РНК-управляемым образом. Нацеленная специфичность определяется комплементарным спариванием оснований единственной направляющей РНК (sgRNA) с геномным локусом. sgRNA представляет собой химерную некодирующую РНК, которую можно подразделить на три области: последовательность спаривания оснований из 20 нуклеотидов, шпилька, связывающая dCas9, из 42 нуклеотидов и терминатор из 40 нуклеотидов (бактерии,[3][4][5] дрожжи,[6] плодовые мошки,[7] данио[8] мышей[9]).

При конструировании синтетической sgRNA модифицируется только последовательность пар оснований из 20 нуклеотидов. Также необходимо учитывать вторичные переменные: эффекты вне мишени (для которых требуется простой запуск BLAST последовательности спаривания оснований), поддержание структуры шпильки, связывающей dCas9, и обеспечение отсутствия сайтов рестрикции в модифицированной sgRNA, поскольку это может создать проблему на последующих этапах клонирования. Благодаря простоте конструкции sgRNA, эту технологию можно масштабировать по всему геному.[10]CRISPRi полагается на образование каталитически неактивного Cas9. Это достигается путем введения точечных мутаций в два каталитических остатка (D10A и H840A) гена, кодирующего Cas9.[11] При этом dCas9 не может расщеплять дцДНК, но сохраняет способность нацеливаться на ДНК. Вместе sgRNA и dCas9 составляют минимальную систему ген-специфической регуляции.[1]

Транскрипционная регуляция

Репрессия

CRISPRi может стерически подавлять транскрипция путем блокирования инициации или удлинения транскрипции. Это достигается путем создания sgRNA, комплементарного промоутер или экзонный последовательности. Уровень репрессии транскрипции с мишенью в кодирующей последовательности зависит от цепи. В зависимости от природы эффектора CRISPR матричная или нематричная цепь приводит к более сильной репрессии.[12]Для dCas9 (на основе системы CRISPR типа 2) репрессия сильнее, когда направляющая РНК комплементарна нематричной цепи. Было высказано предположение, что это связано с активностью геликазы, которая раскручивает гетеродуплекс РНК: ДНК перед РНК pol II когда sgRNA комплементарна цепи матрицы. В отличие от блока элонгации транскрипции, молчание не зависит от целевой цепи ДНК при нацеливании на сайт начала транскрипции. У прокариот это стерическое ингибирование может подавлять транскрипцию целевого гена почти на 99,9%; в клетках человека наблюдалась репрессия до 90%.[1]У бактерий возможно насытить мишень достаточно высоким уровнем комплекса dCas9. В этом случае сила репрессии зависит только от вероятности того, что dCas9 выбрасывается при столкновении с РНК-полимеразой, которая определяется направляющей последовательностью.[13] Более высокие температуры также связаны с более высокой вероятностью выброса, следовательно, более слабым подавлением.[14]У эукариот CRISPRi также может репрессировать транскрипцию через эффекторный домен. Слияние репрессорного домена с dCas9 позволяет дополнительно репрессировать транскрипцию путем индукции гетерохроматинизации. Например, хорошо изученный Связанная коробка Krüppel (KRAB) домен может быть слит с dCas9 для репрессии транскрипции целевого гена до 99% в клетках человека.[15]

Повышение эффективности

В то время как редактирование генома каталитически активной нуклеазой Cas9 может сопровождаться необратимыми геномными изменениями вне мишени, CRISPRi является высокоспецифичным с минимальными обратимыми эффектами вне мишени для двух различных последовательностей sgRNA.[15] Тем не менее, было разработано несколько методов повышения эффективности модуляции транскрипции. Идентификация сайт начала транскрипции целевого гена и с учетом предпочтений sgRNA повышает эффективность, как и наличие доступных хроматин на целевом сайте.[16]

Другие методы

Наряду с другими улучшения Как уже упоминалось, такие факторы, как расстояние от начала транскрипции и локальное состояние хроматина, могут быть критическими параметрами при определении эффективности активации / репрессии. Оптимизация экспрессии, стабильности, ядерной локализации и взаимодействия dCas9 и sgRNA, вероятно, позволит еще больше повысить эффективность CRISPRi в клетках млекопитающих.[1]

Приложения

Джин нокдаун

Было показано, что значительная часть генома (как репортерные, так и эндогенные гены) эукариот может быть нацелена с использованием лентивирусных конструкций для экспрессии dCas9 и sgRNA, с сопоставимой эффективностью с существующими методами, такими как белки RNAi и TALE.[15] В тандеме или в качестве отдельной системы CRISPRi можно использовать для достижения того же Приложения как в RNAi.

Что касается бактерий, нокдаун генов с помощью CRISPRi был полностью реализован и охарактеризован (нецелевой анализ, протекающая репрессия) для грамотрицательных Кишечная палочка [3][5] и грамположительные Б. subtilis.[4]

Рабочий процесс строительства CRISPRi

Аллельный ряд

Дифференциальная экспрессия генов может быть достигнута путем изменения эффективности спаривания оснований sgRNA с целевыми локусами.[10] Теоретически изменение этой эффективности можно использовать для создания аллельного ряда для любого данного гена, по сути создавая коллекцию гипо- и гиперморфов. Эти мощные коллекции можно использовать для проверки любого генетического исследования. За гипоморфы, это позволяет постепенно снижать функцию генов в отличие от бинарной природы нокаутов генов и непредсказуемости нокдаунов. За гиперморфы, это контрастирует с обычным методом клонирования интересующего гена под промоторами с переменной силой.

Визуализация локусов генома

Слияние флуоресцентный белок to dCas9 позволяет получать изображения геномных локусов в живых клетках человека.[17] По сравнению с флуоресцентной гибридизацией in situ (FISH), этот метод уникальным образом позволяет динамически отслеживать локусы хромосом. Это было использовано для изучения архитектуры хроматина и динамики ядерной организации в лабораторных клеточных линиях, включая клетки HeLa.

Стволовые клетки

Активация Факторы Яманаки CRISPRa использовалась для вызывать плюрипотентность в клетках человека и мыши, что является альтернативой технологии iPS.[18][19] Кроме того, крупномасштабные активационные экраны могут быть использованы для идентификации белков, которые способствуют индуцированной плюрипотентности или, наоборот, способствуют дифференцировке в определенный клеточный клон.[20]

Генетический скрининг

Способность повышать экспрессию гена с помощью dCas9-SunTag с одной sgRNA также открывает двери для крупномасштабных генетических скринингов, таких как Perturb-seq, чтобы выявить фенотипы, возникающие в результате повышенной или пониженной экспрессии генов, что будет особенно важно для понимания эффектов регуляции генов при раке.[21] Кроме того, было показано, что системы CRISPRi можно передавать через горизонтальный перенос генов такие механизмы, как бактериальная конъюгация и была продемонстрирована специфическая репрессия репортерных генов в реципиентных клетках. CRISPRi может служить инструментом для генетического скрининга и контроля потенциально бактериальной популяции.[22]

Преимущества и ограничения

Преимущества

  1. CRISPRi может заглушить интересующий целевой ген до 99,9% репрессии.[10] Сила репрессии также может быть настроена путем изменения степени комплементарности между направляющей РНК и мишенью. В отличие от индуцибельных промоторов, частичная репрессия с помощью CRISPRi не добавляет транскрипционный шум к выражению лица.[23] Поскольку уровень репрессии закодирован в последовательности ДНК, различные уровни экспрессии могут быть выращены в конкурентной борьбе и идентифицированы путем секвенирования.[24]
  2. Поскольку CRISPRi основан на спаривании оснований sgRNA-ДНК и мотива NGG PAM по Уотсону-Крику, выбор целевых сайтов в геноме является простым и гибким. Были разработаны тщательно определенные протоколы.[10]
  3. Несколько sgRNA могут использоваться не только для одновременного контроля нескольких различных генов (мультиплексный CRISPRi), но также для повышения эффективности регулирования одной и той же генной мишени. Популярной стратегией одновременной экспрессии множества sgRNA является объединение sgRNA в единую конструкцию с множеством промоторов или процессинговых элементов. Например, в сверхдлинных массивах sgRNA (ELSA) используются неповторяющиеся части, чтобы обеспечить прямой синтез массивов 12-sgRNA от поставщика синтеза генов, можно напрямую интегрировать в Кишечная палочка геном без гомологичной рекомбинации, и может одновременно нацеливаться на многие гены для достижения сложных фенотипов.[25]
  4. Хотя эти две системы могут дополнять друг друга, CRISPRi имеет преимущества перед RNAi. Как экзогенная система CRISPRi не конкурирует с эндогенными механизмами, такими как экспрессия или функция микроРНК. Кроме того, поскольку CRISPRi действует на уровне ДНК, можно нацеливать транскрипты, такие как некодирующие РНК, микроРНК, антисмысловые транскрипты, локализованные в ядре РНК и транскрипты полимеразы III. Наконец, CRISPRi обладает гораздо большим целевым пространством последовательностей; промоторы и, теоретически, интроны также могут быть нацелены.[15]
  5. В Кишечная палочка, конструирование штамма нокдауна гена происходит очень быстро и требует только одноэтапного олигонуклеотида. рекомбинирование.[5]

Ограничения

  1. Требование прилегающий мотив протоспейсера (PAM) последовательность ограничивает количество потенциальных целевых последовательностей. Cas9 и его гомологи могут использовать разные последовательности PAM и, следовательно, теоретически могут использоваться для увеличения числа потенциальных последовательностей-мишеней.[10]
  2. Специфичность последовательности в отношении локусов-мишеней составляет всего 14 нуклеотидов (12 нуклеотидов sgRNA и 2nt PAM), что может повторяться примерно 11 раз в геноме человека.[10] Репрессия обратно коррелирует с расстоянием целевого сайта от сайта начала транскрипции. Вычислительные предсказания по всему геному или выбор гомологов Cas9 с более длинным PAM могут снизить неспецифическое нацеливание.
  3. Эндогенные состояния и модификации хроматина могут препятствовать специфичному для последовательности связыванию комплекса dCas9-sgRNA.[10] Уровень репрессии транскрипции в клетках млекопитающих варьирует в зависимости от генов. Необходима большая работа, чтобы понять роль локальной конформации ДНК и хроматина в отношении связывания и регуляторной эффективности.
  4. CRISPRi может влиять на гены, которые находятся в непосредственной близости от целевого гена. Это особенно важно при нацеливании на гены, которые либо перекрывают другие гены (смысловое или антисмысловое перекрытие), либо управляются двунаправленным промотором.[26]
  5. Сообщалось о токсичности, специфичной для последовательности, у эукариот, при этом некоторые последовательности в PAM-проксимальной области вызывают большую нагрузку на приспособленность.[27] Это явление, называемое «эффектом плохих семян», до сих пор остается необъяснимым, но его можно уменьшить путем оптимизации уровня экспрессии dCas9.[28]

Рекомендации

  1. ^ а б c d е Qi, L. S .; Larson, M. H .; Гилберт, Л. А .; Doudna, J. A .; Weissman, J. S .; Аркин, А.П .; Лим, В. А. (2013). «Использование CRISPR в качестве РНК-управляемой платформы для последовательного контроля экспрессии генов». Клетка. 152 (5): 1173–1183. Дои:10.1016 / j.cell.2013.02.022. ЧВК  3664290. PMID  23452860.
  2. ^ Barrangou, R .; Fremaux, C .; Deveau, H .; Richards, M .; Boyaval, P .; Moineau, S .; Romero, D.A .; Хорват, П. (2007). «CRISPR обеспечивает приобретенную устойчивость к вирусам у прокариот». Наука. 315 (5819): 1709–1712. Дои:10.1126 / science.1138140. HDL:20.500.11794/38902. PMID  17379808. S2CID  3888761.
  3. ^ а б Цзян, Вт; Бикард, Д; Кокс, Д; Чжан, Ф; Марраффини, Л. А. (2013). «РНК-управляемое редактирование бактериальных геномов с использованием систем CRISPR-Cas». Природа Биотехнологии. 31 (3): 233–239. Дои:10.1038 / nbt.2508. ЧВК  3748948. PMID  23360965.
  4. ^ а б Петерс, Дж. М.; и другие. (2016). «Комплексный функциональный анализ основных генов бактерий на основе CRISPR». Клетка. 165 (6): 1493–1506. Дои:10.1016 / j.cell.2016.05.003. ЧВК  4894308. PMID  27238023.
  5. ^ а б c Ли, Х; Jun, Y; Эрикстад, М; Коричневый, S; Парки, А; Суд, D; Июн, S (2016). «tCRISPRi: настраиваемый и обратимый, одноэтапный контроль экспрессии генов». Научные отчеты. 6: 39096. Дои:10.1038 / srep39076. ЧВК  5171832. PMID  27996021.
  6. ^ Dicarlo, J.E .; Norville, J. E .; Мали, P; Риос, X; Аах, Дж; Церковь, Г. М. (2013). «Геномная инженерия Saccharomyces cerevisiae с использованием систем CRISPR-Cas». Исследования нуклеиновых кислот. 41 (7): 4336–4343. Дои:10.1093 / nar / gkt135. ЧВК  3627607. PMID  23460208.
  7. ^ Gratz, S.J .; О'Коннор-Джайлз, К. М. (2013). «Геномная инженерия дрозофилы с помощью CRISPR-РНК-управляемой нуклеазы Cas9». Генетика. 194 (4): 1029–1035. Дои:10.1534 / генетика.113.152710. ЧВК  3730909. PMID  23709638.
  8. ^ Hwang, W. Y .; Fu, Y; Рейон, Д; Maeder, M. L .; Tsai, S. Q .; Sander, J.D .; Peterson, R.T .; Yeh, J. R .; Джунг, Дж. К. (2013). «Эффективное редактирование генома рыбок данио с использованием системы CRISPR-Cas». Природа Биотехнологии. 31 (3): 227–229. Дои:10.1038 / nbt.2501. ЧВК  3686313. PMID  23360964.
  9. ^ Wang, H .; Ян, H .; Shivalila, C. S .; Dawlaty, M. M .; Cheng, A. W .; Zhang, F .; Яениш, Р. (2013). «Одноэтапное создание мышей, несущих мутации в нескольких генах, с помощью CRISPR / Cas-опосредованной геномной инженерии». Клетка. 153 (4): 910–918. Дои:10.1016 / j.cell.2013.04.025. ЧВК  3969854. PMID  23643243.
  10. ^ а б c d е ж грамм Larson, M. H .; Гилберт, Л. А .; Ван, Х; Lim, W. A .; Weissman, J. S .; Ци, Л. С. (2013). «Интерференция CRISPR (CRISPRi) для последовательного контроля экспрессии генов». Протоколы природы. 8 (11): 2180–2196. Дои:10.1038 / nprot.2013.132. ЧВК  3922765. PMID  24136345.
  11. ^ Jinek, M .; Chylinski, K .; Fonfara, I .; Hauer, M .; Doudna, J. A .; Шарпантье, Э. (2012). "Программируемая ДНК-эндонуклеаза, управляемая двойной РНК, в адаптивном бактериальном иммунитете". Наука. 337 (6096): 816–821. Дои:10.1126 / наука.1225829. ЧВК  6286148. PMID  22745249.
  12. ^ Вигуру, Антуан; Бикард, Дэвид (2020-05-20). «Инструменты CRISPR для контроля экспрессии генов в бактериях». Обзоры микробиологии и молекулярной биологии. 84 (2). Дои:10.1128 / MMBR.00077-19. ISSN  1098-5557 1092-2172, 1098-5557 Проверять | issn = ценить (помощь). Получено 2020-04-02.
  13. ^ Вигуру, Антуан; Бикард, Дэвид (2020-05-20). «Инструменты CRISPR для контроля экспрессии генов в бактериях». Обзоры микробиологии и молекулярной биологии. 84 (2). Дои:10.1128 / MMBR.00077-19. ISSN  1098-5557 1092-2172, 1098-5557 Проверять | issn = ценить (помощь). Получено 2020-04-02.Вигуру, Антуан; Олдевуртель, Энно; Цуй, Лун; Бикард, Дэвид; ван Тиффелен, Свен (март 2018 г.). «Настройка способности dCas9 блокировать транскрипцию позволяет надежно и бесшумно нокдаун бактериальных генов». Молекулярная системная биология. 14 (3): –7899. Дои:10.15252 / msb.20177899. ISSN  1744-4292, 1744-4292 1744-4292, 1744-4292, 1744-4292 Проверять | issn = ценить (помощь). Получено 2018-05-15.
  14. ^ Вигуру, Антуан; Олдевуртель, Энно; Цуй, Лун; Бикард, Дэвид; ван Тиффелен, Свен (март 2018 г.). «Настройка способности dCas9 блокировать транскрипцию позволяет надежно и бесшумно нокдаун бактериальных генов». Молекулярная системная биология. 14 (3): –7899. Дои:10.15252 / msb.20177899. ISSN  1744-4292, 1744-4292 1744-4292, 1744-4292, 1744-4292 Проверять | issn = ценить (помощь). Получено 2018-05-15.
  15. ^ а б c d Гилберт, Л. А .; Larson, M. H .; Морсут, Л; Лю, Z; Брар, Г. А .; Torres, S.E .; Штерн-Гиноссар, Н; Брандман, О; Whitehead, E.H .; Doudna, J. A .; Lim, W. A .; Weissman, J. S .; Ци, Л. С. (2013). «CRISPR-опосредованная модульная РНК-управляемая регуляция транскрипции у эукариот». Клетка. 154 (2): 442–451. Дои:10.1016 / j.cell.2013.06.044. ЧВК  3770145. PMID  23849981.
  16. ^ Радзищевская, Александра; Шлюева, Дарья; Мюллер, Ирис (28 июня 2016 г.). «Оптимизация положения sgRNA заметно повышает эффективность CRISPR / dCas9-опосредованной репрессии транскрипции». Исследования нуклеиновых кислот. 44 (18): e141. Дои:10.1093 / нар / gkw583. ЧВК  5062975. PMID  27353328.
  17. ^ Чен, B; Гилберт, Л. А .; Cimini, B.A .; Schnitzbauer, J; Чжан, Вт; Li, G.W .; Парк, Дж; Blackburn, E.H .; Weissman, J. S .; Qi, L. S .; Хуанг, Б. (2013). «Динамическое отображение геномных локусов в живых клетках человека с помощью оптимизированной системы CRISPR / Cas». Клетка. 155 (7): 1479–1491. Дои:10.1016 / j.cell.2013.12.001. ЧВК  3918502. PMID  24360272.
  18. ^ Kearns, N.A .; Genga, R.M .; Enuameh, M. S .; Гарбер, М; Wolfe, S.A .; Maehr, R (2014). «Опосредованная эффектором Cas9 регуляция транскрипции и дифференцировки в плюрипотентных стволовых клетках человека». Разработка. 141 (1): 219–223. Дои:10.1242 / dev.103341. ЧВК  3865759. PMID  24346702.
  19. ^ Ху, Дж; Лей, Y; Wong, W. K .; Лю, S; Ли, К. С .; Он, Х; Вы, W; Чжоу, Р.; Guo, J. T .; Чен, X; Пэн, X; Вс, ч; Хуанг, Н; Чжао, H; Фэн, Б. (2014). «Прямая активация генов Oct4 человека и мыши с использованием сконструированных факторов транскрипции TALE и Cas9». Исследования нуклеиновых кислот. 42 (7): 4375–4390. Дои:10.1093 / нар / gku109. ЧВК  3985678. PMID  24500196.
  20. ^ Takahashi, K .; Яманака, С. (2006). «Индукция плюрипотентных стволовых клеток из эмбриональных и взрослых культур фибробластов мышей с помощью определенных факторов». Клетка. 126 (4): 663–676. Дои:10.1016 / j.cell.2006.07.024. HDL:2433/159777. PMID  16904174.
  21. ^ Tanenbaum, M.E .; Гилберт, Л. А .; Qi, L. S .; Weissman, J. S .; Вейл, Р. Д. (2014). «Система маркировки белков для амплификации сигнала при экспрессии генов и флуоресцентной визуализации». Клетка. 159 (3): 635–646. Дои:10.1016 / j.cell.2014.09.039. ЧВК  4252608. PMID  25307933.
  22. ^ Джи, Вт; Ли, Д; Вонг, Э; Дадлани, П; Динь, Д; Хуанг, V; Кирнс, К; Teng, S; Чен, S; Халибертон, Дж; Heimberg, G; Heineike, B; Рамасубраманиан, А; Стивенс, Т; Helmke, K. J .; Зепеда, V; Qi, L. S .; Лим, В. А. (2014). «Специфическая репрессия гена системой CRISPRi, переданная посредством бактериальной конъюгации». Синтетическая биология ACS. 3 (12): 929–931. Дои:10.1021 / sb500036q. ЧВК  4277763. PMID  25409531.
  23. ^ Вигуру, Антуан; Олдевуртель, Энно; Цуй, Лун; Бикард, Дэвид; ван Тиффелен, Свен (март 2018 г.). «Настройка способности dCas9 блокировать транскрипцию позволяет надежно и бесшумно нокдаун бактериальных генов». Молекулярная системная биология. 14 (3): –7899. Дои:10.15252 / msb.20177899. ISSN  1744-4292, 1744-4292 1744-4292, 1744-4292, 1744-4292 Проверять | issn = ценить (помощь). Получено 2018-05-15.
  24. ^ Хокинс, Джон С .; Сильвис, Мелани Р .; Ку, Бён-Мо; Питерс, Джейсон М .; Йост, Марко; Hearne, Cameron C .; Weissman, Jonathan S .; Тодор, Хория; Гросс, Кэрол А. (15.10.2019). «Модулированная эффективность CRISPRi показывает эволюционное сохранение взаимосвязей между экспрессией и приспособленностью генов у бактерий». bioRxiv: 805333. Дои:10.1101/805333. Получено 2020-01-16.
  25. ^ Рейс, Александр; Хальпер, Шон; Везо, Грейс; Цетнар, Даниэль; Хоссейн, Аян; Клауэр, Филипп; Салис, Ховард (2019). «Одновременная репрессия нескольких бактериальных генов с использованием неповторяющихся сверхдлинных массивов sgRNA». Природа Биотехнологии. 37 (11): 1294–1301. Дои:10.1038 / s41587-019-0286-9. PMID  31591552.
  26. ^ Гоял, Ашиш; Мячева, Ксения; Грос, Матиас; Клингенберг, Марсель; Дюран Арке, Берта; Дидерикс, Свен (30.09.2016). «Проблемы применения CRISPR / Cas9 для генов длинных некодирующих РНК». Исследования нуклеиновых кислот. 45 (3): gkw883. Дои:10.1093 / нар / gkw883. ISSN  0305-1048. ЧВК  5388423. PMID  28180319.
  27. ^ Цуй, Лун; Вигуру, Антуан; Руссе, Франсуа; Варет, Гюго; Ханна, Варун; Бикард, Дэвид (2018-05-15). «Скрининг CRISPRi на E. coli показывает токсичность dCas9, специфичную для последовательности». Nature Communications. 9 (1): 1912. Дои:10.1038 / s41467-018-04209-5. ISSN  2041-1723. Получено 2018-10-17.
  28. ^ Депардье, Флоренция; Бикард, Дэвид (2020-02-01). «Подавление гена с помощью CRISPRi в бактериях и оптимизация уровней экспрессии dCas9». Методы. Методы описания, применения и обучения системам CRISPR-Cas. 172: 61–75. Дои:10.1016 / j.ymeth.2019.07.024. ISSN  1046-2023. Получено 2020-10-25.

внешняя ссылка