Изоляция клеток - Cell isolation

Изоляция клеток это процесс разделения индивидуальной жизни клетки из твердого блока ткани или клеточной суспензии. Хотя некоторые типы клеток естественно существуют в отдельной форме (например, кровяные клетки ), другие типы клеток, которые встречаются в твердой ткани, требуют специальных методов для разделения их на отдельные клетки. Это может быть выполнено с помощью ферменты переварить белки который связывает эти клетки вместе внутри внеклеточный матрикс. После переваривания матричных белков клетки остаются непрочно связанными друг с другом, но их можно аккуратно разделить механически. После выделения можно проводить эксперименты на этих отдельных изолированных клетках, включая патч зажим электрофизиология, кальциево-флуоресцентная визуализация, и иммуноцитохимия. 

Методы

Изображение изолированного взрослого сердечные миоциты взято с использованием конфокальная микроскопия

Циркулирующие клетки

Методы, необходимые для получения изолированных клеток, различаются в зависимости от требуемого типа клеток. Циркулирующие клетки, такие как клетки крови или некоторые опухолевые клетки, можно выделить, взяв образец крови.[1] Поскольку образцы крови содержат смесь многих разных типов клеток, необходимо использовать метод разделения клеток на разные типы. Наиболее часто используемый метод для этого - проточная цитометрия, во время которой автоматический анализатор проверяет узкий поток клеток. В одной из версий этого метода поток клеток освещается светом, и анализатор обнаруживает отраженный свет или флуоресценцию перед использованием этой информации для быстрого перемещения интересующих клеток в камеру для сбора.[2]

Твердые ткани

При работе с твердыми тканями получение ткани для выделения клеток может быть более сложной задачей. Излишки тканей человека иногда могут быть получены во время плановой операции, например, образцы отросток правого предсердия часто вырезаются и выбрасываются во время операция на открытом сердце Такие как операция коронарного шунтирования.[3] Другие ткани, такие как образцы поджелудочной железы или мочевого пузыря, могут быть взяты для биопсии. В качестве альтернативы ткань животных часто получают жертвовать животное.[4]

После получения образца ткани его необходимо окружить или перфузировать раствором соответствующей температуры, содержащим соли и питательные вещества, необходимые для поддержания жизни клеток. Это может быть выполнено путем простого погружения ткани в раствор или может включать более сложные меры, такие как Перфузия Лангендорфа.[3] Обычно используемые решения включали модификации Тирода решение или Решение Кребса и Хенселейта Эти растворы содержат точные концентрации электролитов, включая натрий, калий, кальций, магний, фосфат, хлористый, и глюкоза. Концентрации этих электролитов необходимо тщательно сбалансировать, обращая внимание на осмотическое давление. Кислотность раствора необходимо регулировать, часто используя буфер pH Такие как HEPES. Изоляция клеток из некоторых тканей может быть улучшена путем насыщения раствора кислородом.[3] На начальных этапах перфузия ткани раствором, не содержащим кальция, особенно полезна при выделении сердечные миоциты, так как отсутствие кальция вызывает разделение вставные диски.[5]

Протеолитический ферменты затем можно добавить в раствор. Ферменты, которые переваривают коллаген (коллагеназы ) часто используются при выделении клеток из сердца или мочевого пузыря.[3][4][6] Ферменты общего назначения, которые переваривают многие виды белков (протеазы ) также можно использовать.[3] При выделении клеток из ткани мозга могут потребоваться другие ферменты, расщепляющие ДНК (ДНКазы).[7]

Эти ферменты, помимо переваривания внеклеточного матрикса, также могут переваривать другие важные белки, необходимые для функционирования представляющих интерес клеток. Если клетки подвергаются воздействию этих ферментов слишком долго, это приводит к гибели клеток, но если они не подвергаются воздействию ферментов достаточно долго, переваривание внеклеточного матрикса не будет полным. После того, как ферменты были удалены из ткани путем перфузии ее вторым раствором, не содержащим ферментов, клетки можно механически отделить или диссоциировать. Простая техника диссоциации клеток включает разрезание ткани на небольшие кусочки перед перемешиванием кусочков в растворе с помощью пипетки.[3][4]

Использует

Изолированные клетки можно использовать для изучения того, как клетки работают, как они изменяются в ответ на болезнь и как на них влияют лекарства. Примером экспериментальной техники, использующей изолированные клетки, является патч зажим электрофизиология, используется для изучения того, как заряженные частицы проходят через клеточная мембрана. Дополнительные методы включают: кальциево-флуоресцентная визуализация использование красителей, излучающих свет в ответ на кальций, для измерения того, как кальций регулируется в клетке, и иммуноцитохимия который использует антитела, помеченные флуоресцентным маркером, для определения местонахождения белков в клетке.[8] Изолированные клетки также можно использовать для культура клеток, в котором одна клетка размножается, образуя колонию клеток.[4]

Выделение клеток также можно использовать как часть лечения. Выделение клеток островков поджелудочной железы с последующим их культивированием и трансплантацией использовалось для лечения пациентов с Диабет 1 типа.[9]

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ Бхагват Н., Карпентер Э.Л. (2017). «Методы проточной цитометрии для выделения циркулирующих опухолевых клеток и молекулярного анализа». Достижения экспериментальной медицины и биологии. 994: 105–118. Дои:10.1007/978-3-319-55947-6_5. PMID  28560670.
  2. ^ Ху П, Чжан В, Синь Х, Дэн Г (2016). «Выделение и анализ отдельных клеток». Границы клеточной биологии и биологии развития. 4: 116. Дои:10.3389 / fcell.2016.00116. ЧВК  5078503. PMID  27826548.
  3. ^ а б c d е ж Войт Н., Пирман К.М., Добрев Д., Дибб К.М. (сентябрь 2015 г.). «Методы выделения предсердных клеток от крупных млекопитающих и человека». Журнал молекулярной и клеточной кардиологии. 86: 187–98. Дои:10.1016 / j.yjmcc.2015.07.006. PMID  26186893.
  4. ^ а б c d Лауч В.Е., Шихан К.А., Вольска Б.М. (сентябрь 2011 г.). «Методы выделения, культивирования и переноса генов кардиомиоцитов». Журнал молекулярной и клеточной кардиологии. 51 (3): 288–98. Дои:10.1016 / j.yjmcc.2011.06.012. ЧВК  3164875. PMID  21723873.
  5. ^ Йейтс Дж. К., Дхалла Н. С. (февраль 1975 г.). «Структурные и функциональные изменения, связанные с отказом и восстановлением сердца после перфузии средой без Ca2 +». Журнал молекулярной и клеточной кардиологии. 7 (2): 91–103. Дои:10.1016/0022-2828(75)90011-5. PMID  1121035.
  6. ^ Kloskowski T, Uzarska M, Gurtowska N, Olkowska J, Joachimiak R, Bajek A, Gagat M, Grzanka A, Bodnar M, Marszałek A., Drewa T. (апрель 2014 г.). «Как выделить уротелиальные клетки? Сравнение четырех различных методов и обзор литературы». Человеческая клетка. 27 (2): 85–93. Дои:10.1007 / s13577-013-0070-у. PMID  24368576.
  7. ^ Chew LJ, DeBoy CA, Сенаторов В.В. (октябрь 2014 г.). «Определение степени разделения: экспериментальные подходы к выделению астроглиальных и олигодендроглиальных клеток и генетическому нацеливанию». Журнал методов неврологии. 236: 125–47. Дои:10.1016 / j.jneumeth.2014.08.017. ЧВК  4171043. PMID  25169049.
  8. ^ Франк, Дж .; Biesalski, H.K .; Dominici, S .; Помпелла, А. (январь 2000 г.). «Визуализация оксидантного стресса в тканях и изолированных клетках». Гистология и гистопатология. 15 (1): 173–184. Дои:10.14670 / HH-15.173. ISSN  0213-3911. PMID  10668208.
  9. ^ Киффер Т.Дж., Вольтьен К., Осафуне К., Ябе Д., Инагаки Н. (октябрь 2017 г.). «Стратегии замещения бета-клеток при диабете». Журнал исследований диабета. 9: 457–463. Дои:10.1111 / jdi.12758. ЧВК  5934267. PMID  28984038.

дальнейшее чтение