Компартментализация in vitro - In vitro compartmentalization

В пробирке разделение (IVC) является эмульсия -основанная технология, которая генерирует клеточные компартменты in vitro. Эти отсеки сконструированы таким образом, что в каждом из них содержится не более одного ген. Когда ген записано и / или переведено, его продукция (РНК и / или белки ) становятся «пойманными» кодирующим геном внутри отсека. Соединив генотип (ДНК ) и фенотип (РНК, белок), компартментализация позволяет выбирать и эволюционировать фенотип.

История

Метод компартментализации in vitro был впервые разработан Tawfik et al.[1] Основываясь на идее, что Дарвиновский эволюция опирается на связь генотипа с фенотипом, Tawfik et al. спроектированные водные отсеки воды в масле (без масла) эмульсии имитировать клеточные компартменты, которые могут связывать генотип и фенотип. Эмульсии клеточно-подобных компартментов были сформированы путем добавления in vitro транскрипция /перевод реакционная смесь для перемешивания минерального масла, содержащего поверхностно-активные вещества. Средний диаметр капель, измеренный с помощью лазерной дифракции, составил 2,6 мкм. В качестве доказательства концепции Tawfik el al. разработали эксперимент, который мог бы транскрибировать и транслировать ген M. HaeIII в присутствии 107-кратного избытка генов, кодирующих другой фермент folA. 3 ’каждого гена были специально сконструированы таким образом, чтобы содержать R / M-последовательности HaeIII, и когда метилтрансфераза HaeIII экспрессировалась из гена M.HaeIII, она метилировала бы R / M-последовательность HaeIII и заставляла ген быть устойчивым к перевариванию рестрикционным ферментом. Путем отбора последовательностей ДНК, которые выживают при расщеплении эндонуклеазами, Tawfik el al. обнаружили, что было обогащение генов M.HaeIII, то есть в 1000 раз в первом раунде отбора.

Метод

Рисунок 1. В пробирке компартментализация: цикл отбора

Эмульсионная технология

Эмульсии вода-в-масле (в / м) создаются путем смешивания водной и масляной фаз с помощью поверхностно-активных веществ. Типичная эмульсия IVC образуется сначала путем создания смеси масло-поверхностно-активное вещество путем перемешивания, а затем постепенного добавления водной фазы к смеси масло-поверхностно-активное вещество. Для стабильного образования эмульсии смесь HLB (гидрофильно-липофильный баланс) и поверхностно-активные вещества с низким ГЛБ.[2] Некоторые комбинации поверхностно-активных веществ, используемых для создания смеси масло-поверхностно-активное вещество: минеральное масло / 0,5% Tween 80 / 4,5% Span 80 / дезоксихолат натрия.[3] и более термостойкая версия, легкое минеральное масло / 0,4% Подросток 80 / 4,5% Диапазон 80 / 0,05% Тритон Х-100.[4] Водная фаза, содержащая компоненты транскрипции и / или трансляции, медленно добавляется к масляным поверхностно-активным веществам, и образование в / м облегчается гомогенизацией, перемешиванием или использованием ручного экструдера.

Качество эмульсии можно определить по свету. микроскопия и / или динамическое рассеяние света техники. Эмульсия довольно разнообразная, и большая гомогенизация скорости помогает производить более мелкие капли с более узким распределением по размерам. Однако скорость гомогенизации необходимо контролировать, поскольку скорость более 13 500 об / мин имеет тенденцию приводить к значительной потере активности фермента на уровне транскрипции. Наиболее широко используемое образование эмульсии дает капли со средним диаметром 2-3 мкм и средним объемом ~ 5 фемтолитров, или 1010 водная капля на мл эмульсии.[5] Отношение генов к каплям рассчитано таким образом, что большинство капель статистически содержат не более одного гена.

В пробирке транскрипция / перевод

IVC позволяет миниатюризировать крупномасштабные методы, которые теперь могут быть выполнены в микромасштабе, включая сопряженные in vitro транскрипция и перевод (IVTT) эксперименты. Оптимизация и интеграция транскрипции и перевода позволяет быстро и легко контролировать экспериментальные проекты.[6][7][8] IVTT можно проводить как в объемных эмульсиях, так и в микрокаплях, используя капельная микрофлюидика. Микрокапли, капли в масштабе от пико до фемтолитров, успешно используются в качестве сосудов для одиночных молекул ДНК.[9][10] Эта капельная технология позволяет проводить высокопроизводительный анализ с множеством различных давлений отбора в одной экспериментальной установке.[6][10] IVTT в микрокаплях предпочтительнее, если сверхэкспрессия желаемого белка будет токсичной для клетки-хозяина, сводя к минимуму полезность механизмов транскрипции и трансляции.[11]

IVC использовала экстракты бактериальных клеток, зародышей пшеницы и ретикулоцитов кролика (RRL) для транскрипции и трансляции. Также возможно использовать восстановленную бактериальную систему трансляции, такую ​​как PURE, в которой компоненты трансляции очищаются индивидуально, а затем объединяются. При экспрессии эукариотических или сложных белков желательно использовать эукариотический системы трансляции, такие как экстракт зародышей пшеницы или более совершенная альтернатива, экстракт RRL. Чтобы использовать RRL для транскрипции и трансляции, нельзя использовать традиционный состав эмульсии, поскольку он отменяет трансляцию. Вместо этого была разработана новая рецептура эмульсии: 4% Abil EM90 / легкое минеральное масло, которая продемонстрировала свою функциональность при отжиме люцифераза и человек теломераза.[12]

Разрушение эмульсии и связывание генотипа и фенотипа

После завершения транскрипции и / или трансляции в каплях эмульсия будет разрушена последовательными этапами удаления минерального масла и поверхностно-активных веществ, чтобы обеспечить последующий отбор. На этом этапе крайне важно иметь метод, позволяющий «отслеживать» продукты каждого гена до кодирующего гена, когда они становятся свободно плавающими в гетерогенной популяции молекул. Существует три основных подхода к отслеживанию каждого фенотипа и его генотипа.[13] Первый метод - прикрепить каждую молекулу ДНК с помощью биотин группа и дополнительная кодирующая последовательность для стрептавидин (СТАБИЛЬНЫЙ дисплей).[14] Все вновь образованные белки / пептиды будут в слиянии с молекулами стрептавидина и связываться с их биотинилированной кодирующей последовательностью. Улучшенная версия прикрепляла две молекулы биотина к концам молекулы ДНК, чтобы увеличить жадность между молекулой ДНК и пептидами, слитыми со стрептавидином, и использовали синтетический ген стрептавидина с низким содержанием GC для повышения эффективности и специфичности во время амплификации ПЦР.[15] Второй метод - ковалентно связать ДНК и белок. Были продемонстрированы две стратегии. Первый заключается в формировании слитых белков M.HaeIII.[16] Каждый экспрессируемый белок / полипептид будет в слиянии с ДНК-метилтрансферазным доменом Hae III, который способен ковалентно связываться с фрагментами ДНК, содержащими последовательность 5'-GGC * -3 ', где C * представляет собой 5-фтор-2-дезоксицитидин. Вторая стратегия - использовать мономерный мутант фермента VirD2.[17] Когда белок / пептид экспрессируется в слиянии с белком VirD2 Agrobacterium, он будет связываться со своей кодирующей последовательностью ДНК, которая имеет одноцепочечный выступ, содержащий последовательности узнавания Т-границы VirD2. Третий метод - связать фенотип и генотип с помощью бусинок.[18] Используемые шарики будут покрыты стрептавидином, чтобы обеспечить связывание биотинилированной ДНК, кроме того, шарики также будут отображать родственного партнера связывания с тег сходства который будет экспрессироваться в слиянии с белком / пептидом.

Выбор

В зависимости от выбранного фенотипа будут использоваться стратегии выбора различий. Стратегию отбора можно разделить на три основные категории: отбор для связывания, отбор для катализа и отбор для регулирования.[19] Выбираемый фенотип может варьироваться от РНК до пептида и белка. При отборе для связывания наиболее часто развивающимися фенотипами являются пептиды / белки, которые обладают селективным сродством к определенному антитело или молекула ДНК. Примером может служить отбор белков, имеющих сродство к цинковый палец ДНК Sepp et al.[20] При выборе каталитических белков / РНК обычно выделяются новые варианты с новыми или улучшенными ферментативными свойствами. Например, новый рибозим были отобраны варианты с транс-лигазной активностью, которые демонстрировали множественные обороты.[21] Путем отбора для регулирования можно выбрать ингибиторы нуклеаз ДНК, такие как белковые ингибиторы ДНКазы колицина E7.[22]

Преимущества

По сравнению с другими in vitro технологии отображения, IVC имеет два основных преимущества. Первое преимущество - это способность контролировать реакции внутри капель. Гидрофобные и гидрофильные компоненты можно доставлять в каждую каплю поэтапно без нарушения химической целостности капли, и, таким образом, контролируя, что и когда добавлять, можно контролировать реакцию в каждой капле. Кроме того, в зависимости от характера реакции, которую необходимо провести, можно также изменить pH каждой капли. Совсем недавно использовались фотоклетки, и их участие в реакции регулировалось фотоактивацией.[19] Второе преимущество состоит в том, что IVC позволяет выбирать каталитические молекулы. Например, Griffiths et al. смог выбрать для фосфотриэстераза варианты с более высоким KКот путем определения образования и количества продукта с использованием антител против продукта и проточной цитометрии соответственно.[23]

Связанные технологии

Рекомендации

  1. ^ Тауфик, Д.С. и А.Д. Гриффитс, Искусственные клеточные компартменты для молекулярной эволюции. Nat Biotechnol, 1998. 16 (7): p. 652–6.
  2. ^ Роте, А., Р. Сурджади, Б. Power, Новые белки в эмульсиях с использованием in vitro компартментализация. Trends Biotechnol, 2006. 24 (12): с. 587-92.
  3. ^ Тауфик, Д.С. и А.Д. Гриффитс, Искусственные клеточные компартменты для молекулярной эволюции. Nat Biotechnol, 1998. 16 (7): p. 652-6.
  4. ^ Гадесси, Ф.Дж., Дж. Л. Онг и П. Холлигер, Направленная эволюция функции полимеразы путем компартментализованной саморепликации. Proc Natl Acad Sci U S. A., 2001. 98 (8): p. 4552-7.
  5. ^ Миллер, О.Дж. и др., Направленная эволюцией in vitro компартментализация. Nat Methods, 2006. 3 (7): p. 561-70.
  6. ^ а б Кастро-Роа, Даниэль; Зенкин, Николай (2015). «Методология анализа транскрипции и трансляции в системах транскрипции и трансляции in vitro». Методы. 86: 51–59. Дои:10.1016 / j.ymeth.2015.05.029. PMID  26080048.
  7. ^ Люк, C (2004). «Производство серпина с использованием быстрых систем транскрипции / трансляции in vitro». Методы. 32 (2): 191–198. Дои:10.1016 / с1046-2023 (03) 00211-1. PMID  14698632.
  8. ^ Theberge, Ashleigh B .; Куртуа, Фабьен; Шаэрли, Иоланда; Фишлехнер, Мартин; Абелл, Крис; Холлфельдер, Флориан; Гек, Вильгельм Т. С. (09.08.2010). «Микрокапли в микрофлюидике: развивающаяся платформа для открытий в химии и биологии» (PDF). Angewandte Chemie International Edition. 49 (34): 5846–5868. Дои:10.1002 / anie.200906653. ISSN  1521-3773. PMID  20572214.
  9. ^ Кинцес, Балинт; Влит, Лийза Д. ван; Девениш, Шон Р.А.; Холлфельдер, Флориан (2010). «Микрожидкостные капли: новые интегрированные рабочие процессы для биологических экспериментов». Современное мнение в области химической биологии. 14 (5): 548–555. Дои:10.1016 / j.cbpa.2010.08.013. PMID  20869904.
  10. ^ а б Куртуа, Фабьен; Olguin, Луис Ф .; Уайт, Грэм; Браттон, Дэниел; Huck, Wilhelm T. S .; Абелл, Крис; Холлфельдер, Флориан (15 февраля 2008 г.). «Интегрированное устройство для мониторинга зависящей от времени экспрессии in vitro отдельных генов в каплях пиколитра». ChemBioChem. 9 (3): 439–446. Дои:10.1002 / cbic.200700536. ISSN  1439-7633. PMID  18232037.
  11. ^ Колин, Пьер-Ив; Зинченко Анастасия; Холлфельдер, Флориан (2015). «Ферментная инженерия в биомиметических компартментах». Текущее мнение в структурной биологии. 33: 42–51. Дои:10.1016 / j.sbi.2015.06.001. PMID  26311177.
  12. ^ Гадесси, Ф.Дж. и П. Холлигер, Новая эмульсионная смесь для in vitro компартментализация транскрипции и трансляции в системе ретикулоцитов кролика. Protein Eng Des Sel, 2004. 17 (3): p. 201-4.
  13. ^ Leemhuis, H., et al., Новые связи генотип-фенотип для направленной эволюции функциональных белков. Curr Opin Struct Biol, 2005. 15 (4): с. 472-8.
  14. ^ Yonezawa, M., et al., ДНК-дисплей биологически активных белков для in vitro выбор белка. J Biochem, 2004. 135 (3): p. 285-8.
  15. ^ Yonezawa, M., et al., ДНК-дисплей для in vitro выбор разнообразных пептидных библиотек. Nucleic Acids Res, 2003. 31 (19): с. e118.
  16. ^ Бертшингер, Дж. И Д. Нери, Ковалентная ДНК как новый инструмент для направленной эволюции белков in vitro. Protein Eng Des Sel, 2004. 17 (9): p. 699-707.
  17. ^ де Фигейредо, П., Р.Л. Робертс и Э.В. Нестер, DART: основанный на ДНК in vitro технология отображения полипептидов. Протеомика, 2004. 4 (10): с. 3128-40.
  18. ^ Норд О., Улен М., П.А. Nygren, Отображение белков на микрошариках путем внеклеточной экспрессии заякоренной ДНК. J. Biotechnol, 2003. 106 (1): p. 1-13.
  19. ^ а б Гриффитс, А.Д. и Д.С. Тауфик, Миниатюризация лаборатории в каплях эмульсии. Trends Biotechnol, 2006. 24 (9): с. 395-402.
  20. ^ Сепп А. и Ю. Чу, Бесклеточный отбор ДНК-связывающих белков с цинковыми пальцами с использованием in vitro компартментализация. J Mol Biol, 2005. 354 (2): p. 212-9.
  21. ^ Леви, М., К.Е. Грисволд, А.Д.Эллингтон, Прямой отбор транс-действующих лигазных рибозимов с помощью in vitro компартментализация. РНА, 2005. 11 (10): с. 1555-62.
  22. ^ Бернат К., С. Магдасси и Д.С. Тауфик, Направленная эволюция белковых ингибиторов ДНК-нуклеаз с помощью in vitro компартментализация (IVC) и доставка нанокапель. J Mol Biol, 2005. 345 (5): p. 1015-26.
  23. ^ Гриффитс, А.Д. и Д.С. Тауфик, Направленная эволюция чрезвычайно быстрой фосфотриэстеразы с помощью IVC. EMBO J, 2003. 22 (1): с. 24-35.