Кристаллизация белка - Protein crystallization

Кристаллы белков, выращенных на НАС. Космический шатл или же русский Космическая станция, Мир.

Кристаллизация белка представляет собой процесс образования регулярного массива отдельных белковых молекул, стабилизированных кристаллическими контактами. Если кристалл достаточно упорядочен, он будет преломлять. Некоторые белки естественным образом образуют кристаллические массивы, например аквапорин в хрусталике глаза.[1]

В процессе кристаллизации белка белки растворяются в водной среде и растворе пробы до тех пор, пока не достигнут перенасыщенное состояние.[2] Для достижения этого состояния используются различные методы, такие как диффузия пара, микродиализ, микродиализ и диффузия через свободный интерфейс. Развитие кристаллов протеина - сложный процесс, на который влияют многие факторы, включая pH, температуру, ионную силу в растворе для кристаллизации и даже гравитацию.[2] После образования эти кристаллы можно использовать в структурная биология для изучения молекулярной структуры белка, особенно для различных промышленных или медицинских целей.[3][4]

Развитие кристаллизации белка

Более 150 лет ученым известно о кристаллизации белковых молекул.[5]

Кристаллы гемоглобина SC наблюдаются под микроскопом.

В 1840 году Фридрих Людвиг Хюнефельд случайно обнаружил образование кристаллического материала в образцах крови дождевого червя, помещенных под двумя предметными стеклами, и иногда наблюдал небольшие пластинчатые кристаллы в высушенных образцах крови свиней или человека. Эти кристаллы были названы «гемоглобином» Феликсом Хоппе-Сейлером в 1864 году. Основополагающие открытия Хюнефельда вдохновили многих ученых в будущем.[6]

В 1851 году Отто Функе описал процесс получения кристаллов гемоглобина человека путем разбавления красных кровяных телец растворителями, такими как чистая вода, спирт или эфир, с последующим медленным испарением растворителя из раствора белка. В 1871 году профессор Йенского университета Уильям Т. Прейер опубликовал книгу под названием Die Blutkrystalle («Кристаллы крови»), в которой рассматриваются особенности кристаллов гемоглобина около 50 видов млекопитающих, птиц, рептилий и рыб.[6]

В 1909 году физиолог Эдвард Т. Райхерт вместе с минералогом Амосом П. Брауном опубликовали трактат о получении, физиологии и геометрических характеристиках кристаллов гемоглобина нескольких сотен животных, включая вымершие виды, такие как тасманский волк.[6] Были обнаружены увеличивающиеся кристаллы белка.

В 1934 г. Джон Десмонд Бернал и его ученик Дороти Ходжкин обнаружили, что кристаллы белка, окруженные маточной жидкостью, дают лучшие дифракционные картины, чем высушенные кристаллы. С помощью пепсин, они были первыми, кто различил дифрактограмму влажного глобулярного белка. До Бернала и Ходжкина кристаллография белков выполнялась только в сухих условиях с противоречивыми и ненадежными результатами. Это первая картина дифракции рентгеновских лучей кристалла белка.[7]

В 1958 году о структуре миоглобина (красного белка, содержащего гем), определенной с помощью рентгеновской кристаллографии, впервые сообщил ученый. Джон Кендрю.[8] Кендрю поделился 1962 г. Нобелевская премия по химии с Макс Перуц за это открытие.[3]

Теперь, основанные на кристаллах белка, их структуры играют важную роль в биохимии и трансляционной медицине.

Основы кристаллизации белков

Лизоцим кристаллы наблюдаются через поляризационный фильтр.

Теория кристаллизации белков

Суть образования кристаллов заключается в том, чтобы раствор образца достиг пересыщенного состояния.[2] Перенасыщение определено McPherson et al. 2014 как «неравновесное состояние, при котором некоторое количество макромолекулы, превышающее предел растворимости, при определенных химических и физических условиях, тем не менее, присутствует в растворе».[2] Образование твердых частиц в растворе, таких как агрегаты и кристаллы, способствует восстановлению равновесия. Система хочет восстановить равновесие, чтобы каждый компонент в выражении энергии был минимальным.[2] В выражение энергии входят три основных фактора: энтальпия (∆H), энтропия (∆S) и температура (T).[9] ∆H в этом выражении относится к ∆H химических связей, которые образуются и разрываются в результате реакций или фазовых переходов.[9] ∆S относится к степени свободы или измерению неопределенности, которую могут иметь молекулы.[9] Спонтанность процесса, свободная энергия Гибба (∆G), определяется как ∆G = ∆H- T∆S.[9] Следовательно, увеличение ∆S или уменьшение ∆H способствует спонтанности всего процесса, делая ∆G более отрицательным, таким образом достигая минимального энергетического состояния системы.[9] При образовании кристаллов молекулы белка становятся более упорядоченными, что приводит к уменьшению ∆S и делает ∆G более положительным.[10] Следовательно, для спонтанной кристаллизации требуется достаточно отрицательное значение ∆H, чтобы преодолеть потерю энтропии из более упорядоченной системы.[10]

Молекулярный взгляд на переход от раствора к кристаллу

Формирование кристаллов требует двух этапов: зарождения и роста.[2] Зарождение зародышей - это этап инициации кристаллизации.[2] На стадии зародышеобразования молекулы белка в растворе объединяются в агрегаты, образуя стабильное твердое ядро.[2] По мере образования ядра кристалл становится все больше и больше за счет молекул, прикрепленных к этому стабильному ядру.[2] Стадия зародышеобразования имеет решающее значение для образования кристаллов, поскольку это фазовый переход первого рода образцов, переходящих от высокой степени свободы к упорядоченному состоянию (от водного к твердому).[2] Для успешного прохождения стадии зародышеобразования необходимо изменение параметров кристаллизации. Подход, лежащий в основе кристаллизации белка, заключается в снижении растворимости целевого белка в растворе.[2] После превышения предела растворимости и появления кристаллов кристаллизация завершается.[2]

Способы кристаллизации белков

Диффузия пара

Три метода приготовления кристаллов: A: висящая капля. B: Падение сидя. C: микродиализ

Диффузия пара - наиболее часто используемый метод кристаллизации белка. В этом методе капли, содержащие очищенный белок, буфер и осадитель, оставляют для уравновешивать с большим резервуаром, содержащим аналогичные буферы и осадители в более высоких концентрациях. Первоначально капля белкового раствора содержит сравнительно низкие концентрации осадителя и белка, но по мере уравновешивания капли и резервуара концентрации осадителя и белка в капле возрастают. Если для данного белка используются соответствующие растворы для кристаллизации, в капле происходит рост кристаллов.[11][12] Этот метод используется потому, что он позволяет мягко и постепенно изменять концентрацию белка и концентрацию осадителя, что способствует росту крупных и хорошо упорядоченных кристаллов.

Диффузия пара может осуществляться как висящим, так и в вертикальном формате. Аппарат "висящая капля" включает каплю раствора белка, помещенную на перевернутое покровное стекло, которое затем подвешивается над резервуаром. Аппарат для кристаллизации сидя-капля помещает каплю на пьедестал, отделенный от резервуара. Оба эти метода требуют герметизации окружающей среды, чтобы можно было уравновесить каплю и резервуар.[11][13]

Микробатч

Микропакет обычно включает погружение очень небольшого объема капелек белка в масло (всего 1 мкл). Причина, по которой требуется масло, заключается в том, что используется такой малый объем белкового раствора и, следовательно, необходимо предотвратить испарение для проведения эксперимента в водном режиме. Хотя можно использовать различные масла, два наиболее распространенных герметика - это парафиновые масла (описанные Chayen et al.) И силиконовые масла (описанные D’Arcy). Существуют также другие методы микродозирования, в которых не используется жидкий герметизирующий агент, а вместо этого требуется, чтобы ученый быстро наклеил пленку или ленту на пластину с отверстиями после помещения капли в лунку.

Помимо очень ограниченного количества необходимых образцов, этот метод также имеет дополнительное преимущество, заключающееся в том, что образцы защищены от загрязнения воздухом, поскольку они никогда не подвергаются воздействию воздуха во время эксперимента.

Микродиализ

Микродиализ использует полупроницаемую мембрану, через которую могут проходить небольшие молекулы и ионы, в то время как белки и крупные полимеры не могут проходить. Устанавливая градиент концентрации растворенного вещества на мембране и позволяя системе двигаться к равновесию, система может медленно двигаться в сторону перенасыщения, при котором могут образовываться кристаллы белка.

Микродиализ может производить кристаллы путем высаливания с использованием высоких концентраций соли или других небольших проницаемых для мембран соединений, которые снижают растворимость белка. В очень редких случаях некоторые белки могут кристаллизоваться путем диализа, солей, диализа против чистой воды, удаления растворенных веществ, самоассоциации и кристаллизации.

Распространение через свободный интерфейс

Этот метод объединяет растворы белка и осаждения без их предварительного смешивания, а вместо этого вводит их через обе стороны канала, обеспечивая равновесие за счет диффузии. Два раствора вступают в контакт в камере для реагентов, оба при максимальной концентрации, инициируя спонтанное зародышеобразование. Когда система приходит в равновесие, уровень пересыщения снижается, что способствует росту кристаллов.[14]

Факторы, влияющие на кристаллизацию белка

pH

Основная движущая сила кристаллизации белка - это оптимизация количества связей, которые можно образовать с другим белком посредством межмолекулярных взаимодействий.[2] Эти взаимодействия зависят от электронной плотности молекул и боковых цепей белка, которые изменяются в зависимости от pH.[9] Третичная и четвертичная структура белков определяется межмолекулярными взаимодействиями между боковыми группами аминокислот, при которых гидрофильные группы обычно обращены наружу к раствору, образуя гидратную оболочку для растворителя (воды).[9] При изменении pH заряд на этих полярных боковых группах также изменяется в зависимости от pH раствора и pKa белка. Следовательно, выбор pH важен либо для содействия образованию кристаллов, где связь между молекулами друг с другом более благоприятна, чем с молекулами воды.[9] pH - одна из самых мощных манипуляций, которые можно назначить для оптимальных условий кристаллизации.

Температура

Температура - еще один интересный параметр для обсуждения, поскольку растворимость белка зависит от температуры.[15] При кристаллизации белка одной из распространенных стратегий является изменение температуры для получения успешных кристаллов. В отличие от pH, температура различных компонентов кристаллографических экспериментов может повлиять на конечные результаты, такие как температура приготовления буфера,[16] температура фактического эксперимента по кристаллизации и т. д.

Химические добавки

Химические добавки - это небольшие химические соединения, которые добавляют в процессе кристаллизации для увеличения выхода кристаллов.[17] Роль малых молекул в кристаллизации белка вначале не была хорошо продумана, поскольку в большинстве случаев они рассматривались как загрязнители.[17] Более мелкие молекулы кристаллизуются лучше, чем макромолекулы, такие как белки, поэтому использование химических добавок было ограничено до исследования Макферсона. Тем не менее, это важный аспект экспериментальных параметров кристаллизации, который важен для биохимиков и кристаллографов для дальнейшего изучения и применения.[17]

Технологии, способствующие кристаллизации белка

Скрининг кристаллизации с высокой пропускной способностью [18]

Существуют высокопроизводительные методы, которые помогают упростить большое количество экспериментов, необходимых для изучения различных условий, необходимых для успешного роста кристаллов. Для заказа доступны многочисленные коммерческие наборы, в которых предварительно собранные ингредиенты используются в системах, гарантирующих успешную кристаллизацию. Используя такой набор, ученый избегает хлопот по очистке белка и определению подходящих условий кристаллизации.

Обработка жидкостей роботы может использоваться для постановки и автоматизации большого количества экспериментов по кристаллизации одновременно. То, что в противном случае было бы медленным и потенциально подверженным ошибкам процессом, выполняемым человеком, может быть выполнено эффективно и точно с помощью автоматизированной системы. В роботизированных системах кристаллизации используются те же компоненты, которые описаны выше, но каждый этап процедуры выполняется быстро и с большим количеством повторов. В каждом эксперименте используются крошечные количества раствора, причем меньший размер имеет двойное преимущество: меньшие размеры образцов не только сокращают расход очищенного белка, но и меньшие количества раствора приводят к более быстрой кристаллизации. За каждым экспериментом следит камера, которая определяет рост кристаллов.[12]

Белковая инженерия

Белки могут быть сконструированы так, чтобы повысить шансы на успешную кристаллизацию белка, используя такие методы, как уменьшение поверхностной энтропии.[19] или инженерия в кристаллических контактах.[20] Часто проблематично цистеин остатки можно заменить аланином, чтобы избежать дисульфид -опосредованная агрегация, и такие остатки, как лизин, глутамат и глутамин, могут быть заменены на аланин, чтобы уменьшить внутреннюю гибкость белка, что может препятствовать кристаллизации.

Применение кристаллографии белков

Макромолекулярные структуры могут быть определены из кристаллов белка с использованием различных методов, включая Дифракция рентгеновских лучей /Рентгеновская кристаллография, Криогенная электронная микроскопия (CryoEM) (включая Электронная кристаллография и Дифракция электронов на микрокристаллах (MicroED) ), Малоугловое рассеяние рентгеновских лучей, и Нейтронная дифракция. Смотрите также Структурная биология.

Кристаллизация белков также может быть полезна при приготовлении белков для фармацевтических целей.[21]

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ Schey, Kevin L .; Ван, Чжэнь; Л. Венке, Джейми; Ци, Инь (май 2014 г.). «Аквапорины в глазу: выражение, функции и роль в глазных заболеваниях». Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Общие предметы. 1840 (5): 1513–1523. Дои:10.1016 / j.bbagen.2013.10.037. ЧВК  4572841. PMID  24184915.
  2. ^ а б c d е ж грамм час я j k л м Макферсон, Александр; Гавира, Хосе А. (24 декабря 2013 г.). «Введение в кристаллизацию белков». Acta Crystallographica Раздел F. 70 (1): 2–20. Дои:10.1107 / с2053230x13033141. ISSN  2053–230X. ЧВК  3943105. PMID  24419610.
  3. ^ а б Бланделл, Том Л. (29.06.2017). «Кристаллография белков и открытие лекарств: воспоминания об обмене знаниями между академией и промышленностью». IUCrJ. 4 (4): 308–321. Дои:10.1107 / с2052252517009241. ISSN  2052-2525. ЧВК  5571795. PMID  28875019.
  4. ^ Трипатия, Дебу; Бардия, Адитья; Продавцы, Уильям Р. (28 марта 2017 г.). «Рибоциклиб (LEE011): механизм действия и клиническое воздействие этого селективного ингибитора циклинзависимой киназы 4/6 в различных солидных опухолях». Клинические исследования рака. 23 (13): 3251–3262. Дои:10.1158 / 1078-0432.ccr-16-3157. ISSN  1078-0432. ЧВК  5727901. PMID  28351928.
  5. ^ Макферсон, Александр (март 1991). «Краткая история роста кристаллов белка». Журнал роста кристаллов. 110 (1–2): 1–10. Bibcode:1991JCrGr.110 .... 1М. Дои:10.1016/0022-0248(91)90859-4. ISSN  0022-0248.
  6. ^ а б c Giegé, Ричард (декабрь 2013 г.). «Исторический взгляд на кристаллизацию белка с 1840 года до наших дней». Журнал FEBS. 280 (24): 6456–6497. Дои:10.1111 / фев.12580. ISSN  1742-4658. PMID  24165393.
  7. ^ Тулинский, А. (1996), Глава 35. Проект структуры белка, 1950–1959 годы: первые согласованные усилия по определению структуры белка в США., Годовые отчеты по медицинской химии, 31, Elsevier, стр. 357–366, Дои:10.1016 / s0065-7743 (08) 60474-1, ISBN  9780120405312
  8. ^ KENDREW, J. C .; BODO, G .; DINTZIS, H.M .; PARRISH, R. G .; WYCKOFF, H .; ФИЛЛИПС, Д. К. (март 1958 г.). "Трехмерная модель молекулы миоглобина, полученная с помощью рентгеновского анализа". Природа. 181 (4610): 662–666. Bibcode:1958Натура.181..662K. Дои:10.1038 / 181662a0. ISSN  0028-0836. PMID  13517261.
  9. ^ а б c d е ж грамм час Бойл, Джон (январь 2005 г.). "Принципы Ленингера биохимии (4-е изд.): Нельсон, Д., и Кокс, М.". Биохимия и молекулярная биология образование. 33 (1): 74–75. Дои:10.1002 / bmb.2005.494033010419. ISSN  1470-8175.
  10. ^ а б МАКФЕРСОН, Александр (апрель 1990 г.). «Современные подходы к кристаллизации макромолекул». Европейский журнал биохимии. 189 (1): 1–23. Дои:10.1111 / j.1432-1033.1990.tb15454.x. ISSN  0014-2956. PMID  2185018.
  11. ^ а б Родс, Г. (2006) Crystallography Made Crystal Clear, Third Edition: A Guide for Users of Macromolecular Models, 3rd Ed., Academic Press
  12. ^ а б "Хрустальный робот". Декабрь 2000 г.. Получено 2003-02-18.
  13. ^ Макри, Д. (1993). Практическая кристаллография белков. Сан-Диего: Academic Press. С. 1–23. ISBN  978-0-12-486052-0.
  14. ^ Рупп, Бернхард (20 октября 2009 г.). Биомолекулярная кристаллография: принципы, практика и применение в структурной биологии. Наука о гирляндах. п. 800. ISBN  9781134064199. Получено 28 декабря 2016.
  15. ^ Pelegrine, D.H.G .; Гаспаретто, К.А. (Февраль 2005 г.). «Растворимость сывороточных белков в зависимости от температуры и pH». LWT - Пищевая наука и технологии. 38 (1): 77–80. Дои:10.1016 / j.lwt.2004.03.013. ISSN  0023-6438.
  16. ^ Чен, Жуй-Цин; Лу, Цинь-Цинь; Ченг, Цин-Ди; Ао, Лян-Бо; Чжан, Чен-Янь; Хоу, Хай; Лю, Юн-Мин; Ли, Да-Вэй; Инь Да-Чуань (19 января 2015 г.). «Игнорируемая переменная: температура приготовления раствора при кристаллизации белка». Научные отчеты. 5 (1): 7797. Bibcode:2015НатСР ... 5E7797C. Дои:10.1038 / srep07797. ISSN  2045-2322. ЧВК  4297974. PMID  25597864.
  17. ^ а б c Макферсон, Александр; Кадни, Боб (декабрь 2006 г.). «В поисках серебряных пуль: альтернативная стратегия кристаллизации макромолекул» (PDF). Журнал структурной биологии. 156 (3): 387–406. Дои:10.1016 / j.jsb.2006.09.006. ISSN  1047-8477. PMID  17101277.
  18. ^ Линь Ибинь (20 апреля 2018 г.). «Что произошло за последние пять лет с высокопроизводительным скринингом кристаллизации белка?». Мнение эксперта об открытии лекарств. 13 (8): 691–695. Дои:10.1080/17460441.2018.1465924. PMID  29676184.
  19. ^ Купер, Дэвид Р .; Бочек, Томаш; Грелевская, Катаржина; Пинковская, Малгожата; Сикорска, Малгожата; Завадски, Михал; Деревенда, Зигмунт (01.05.2007). «Кристаллизация белка путем уменьшения поверхностной энтропии: оптимизация стратегии SER». Acta Crystallographica Раздел D Биологическая кристаллография. 63 (5): 636–645. Дои:10.1107 / S0907444907010931. ISSN  0907-4449. PMID  17452789.
  20. ^ Gonen, S .; DiMaio, F .; Gonen, T .; Бейкер, Д. (19.06.2015). «Дизайн упорядоченных двумерных массивов, опосредованных нековалентными межбелковыми интерфейсами». Наука. 348 (6241): 1365–1368. Bibcode:2015Научный ... 348.1365G. Дои:10.1126 / science.aaa9897. ISSN  0036-8075. PMID  26089516.
  21. ^ Джен, А., и Меркл, Х. П. (2001) Необработанные алмазы: кристаллы белка с точки зрения рецептуры Pharm Res 18, 1483–1488

внешняя ссылка