Сюрвейерский анализ нуклеазы - Surveyor nuclease assay

Схема рабочего процесса инспектора нуклеазного анализа

Сюрвейерский анализ нуклеазы это анализ расщепления ферментным несоответствием, используемый для обнаружения несоответствия по одной базе или небольшие вставки или удаления (инделы ).

Нуклеаза Surveyor является частью семейства специфичных для несоответствия эндонуклеазы обнаруженные в сельдерее (нуклеазы CEL).[1] Фермент распознает все замены оснований и вставки / делеции и расщепляет 3'-сторону несовпадающих сайтов в обеих цепях ДНК с высокой специфичностью.[2]

Этот анализ использовался для идентификации и анализа мутаций в различных организмах и типах клеток, а также для подтверждения модификаций генома после редактирования генома (с использованием CRISPR /ТАЛЕНЫ /цинковые пальцы ).

Фон

Способность обнаруживать известные и неизвестные мутации имеет большое значение в биомедицинских исследованиях и генетической диагностике (см. Приложения). Поэтому было разработано несколько методов, позволяющих обнаруживать такие мутации на основе исследований и клинической диагностики.

Самый прямой способ определить изменения / различия последовательностей - это считывание последовательности ДНК с помощью традиционных и высокопроизводительных методов секвенирования ДНК (см. Секвенирование по Сэнгеру и Секвенирование ДНК ). Однако эти методы предоставляют большие объемы ненужных данных и дороги в использовании.[3] Кроме того, традиционное секвенирование может быть полезно для обнаружения мутаций зародышевой линии, но может быть менее успешным при обнаружении минорных соматических аллелей на низких частотах (мозаика ). Следовательно, требуются другие подходы, не основанные на секвенировании, для обнаружения мутации или полиморфизмов.

Другие широко используемые методы зависят от физических свойств ДНК, например, системы на основе температуры плавления, такие как Одноцепочечный конформационный полиморфизм анализ (SSCP) и Денатурирующая высокоэффективная жидкостная хроматография (DHPLC). Эти методы обычно ограничиваются анализом коротких фрагментов ДНК (<1000 п.н.) и могут указывать только на наличие полиморфизма (ов), но не позволяют легко определить местоположение мутации в последовательности ДНК. Следовательно, это должно сопровождаться дополнительными методами, чтобы точно определить мутацию или сопоставить несколько мутаций в одном и том же фрагменте.[3]

В анализах ферментативного расщепления несовпадений используются свойства эндонуклеаз, специфичных для несовпадений, для обнаружения и расщепления несовпадений. Эти методы просты в использовании с использованием стандартных лабораторных методов и оборудования и могут обнаруживать полиморфизмы, несоответствия одиночных пар оснований, а также вставки и делеции на низких частотах.[4] Было обнаружено несколько таких ферментов (включая CEL I, эндонуклеазу Т4 VII, эндонуклеазу V, эндонуклеазу I Т7).[3]

Одним из широко используемых ферментов является нуклеаза Surveyor (CEL II), которая расщепляет 3'-сторону обеих цепей ДНК с высокой специфичностью в сайтах замещения или вставки / делеции оснований. Этот фермент способен к расщеплению при множественных мутациях в больших фрагментах ДНК и дает поддающиеся обнаружению продукты расщепления из ошибочно спаренной ДНК, представляющей лишь небольшую часть ДНК в популяции, что делает его пригодным для использования в анализах ферментативного расщепления из-за несовпадения.[2]

История

В 1998 году Olekowski et al.[5] идентифицировали новую эндонуклеазу, специфичную для несоответствия. Фермент был очищен от сельдерея и получил название CEL I.

Было показано, что CEL I разрезает ДНК с высокой специфичностью на обеих цепях на 3'-стороне несовпадений с заменой оснований и, следовательно, может использоваться в методах обнаружения мутаций ферментов для идентификации мутаций и полиморфизмов. Олековски и его коллеги продемонстрировали эту технику, используя этот фермент для обнаружения различных мутаций и полиморфизмов в гене BRCA1 человека.[1][5][6]

При мониторинге очистки CEL я использовал электрофорез в полиакриламидном геле, Ян и др.[1] заметил, что были две полосы нуклеазы, которые оставались вместе на всех этапах очистки. Основная нуклеазная активность была обозначена как CEL I, а второстепенная активность в SDS-PAGE была названа CEL II. Они пришли к выводу, что CEL I и CEL II похожи, и что оба способны расщеплять несоответствие ДНК.

В 2004 году Qiu et al. разработали технологию обнаружения мутаций на основе CEL II, также известного как Surveyor Nuclease.[2] С тех пор этот метод использовался для обнаружения мутаций и полиморфизмов во многих различных организмах и типах клеток (см. Приложения).

Нуклеаза Surveyor была лицензирована Онкологический центр Fox Chase к Transgenomic, Inc. и впоследствии был продан IDT, который в настоящее время его распространяет.

Рабочий процесс анализа нуклеазы Surveyor

Извлечение ДНК

Первоначально интересующая ДНК (ядерная или митохондриальная ДНК ) извлекается из тканей или клеточной культуры. Это может быть выполнено стандартными методами экстракции, такими как расщепление протеиназой К с последующим осаждением этанолом или другими коммерчески доступными методами.

Если предполагается, что ДНК будет гетерогенной, например из пула дифференциально модифицированных клеток или от носителей гетерозиготных мутаций нет необходимости добавлять контрольную ДНК.

Полимеразной цепной реакции

Интересующая область как в мутантной, так и в эталонной ДНК дикого типа амплифицируется с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Реакцию ПЦР следует проводить с использованием высокоточной корректирующей полимеразы, чтобы избежать ошибок ПЦР, которые будут интерпретироваться нуклеазой. Реакция ПЦР должна быть оптимизирована для создания единственной сильной полосы ПЦР, поскольку неспецифические полосы увеличивают фоновый шум анализа.

Если ожидается, что интересующий аллель будет присутствовать с низкой частотой, например, в случае соматического мозаика или гетероплазматической митохондриальной ДНК, можно было бы рассмотреть модифицированный протокол ПЦР, который обогащает вариантные аллели из смеси ДНК дикого типа и ДНК, содержащей мутации (например, ХОЛОДНАЯ ПЦР ).

Формирование гибридного дуплекса ДНК

Интересующая ДНК денатурируется и отжигается для образования гетеродуплексов, содержащих несоответствие в точке мутации, которые затем могут быть идентифицированы нуклеазой Surveyor. Если предполагается, что ДНК будет гомогенной (например, гомоплазматическая митохондриальная ДНК или идентичные аллели на обеих хромосомах геномной ДНК), то необходима ДНК из контрольного образца для образования гетеродуплекса, который затем распознается нуклеазой. Если образец ДНК неоднороден, дополнительная контрольная ДНК не требуется; однако продукты ПЦР все же необходимо денатурировать и отжигать для создания гетеродуплексов.

Пищеварение

Отожженную ДНК обрабатывают нуклеазой Surveyor для расщепления гетеродуплексов. Все типы несоответствий идентифицируются нуклеазой Surveyor, хотя предпочтения по разделению несоответствий делятся на четыре группы от наиболее до наименее предпочтительных: CT, AC и CC в равной степени предпочтительнее TT, за ними следуют AA и GG и, наконец, следуют наименее предпочтительные , AG и GT. Контекст последовательности также влияет на скорость переваривания нуклеазы Surveyor.[2]

Анализ

Продукты расщепленной ДНК можно анализировать с помощью обычного гель-электрофореза или капиллярного электрофореза высокого разрешения. Обнаружение продуктов расщепления указывает на присутствие гетеродуплекса, образованного несовпадением. Местоположение мутации / полиморфизма можно определить, наблюдая за длиной фрагмента после расщепления. Если флуоресцентно меченые праймеры используются для маркировки 5 ’и 3’ конца продуктов ПЦР, в анализе будут наблюдаться полосы разного цвета. Размер каждой полосы независимо подтверждает положение мутации / полиморфизма. Множественные мутации можно обнаружить по наличию нескольких фрагментов.[1][5]

Преимущества и ограничения

Преимущества

Преимущества тестов на несоответствие нуклеазы

Одно из основных преимуществ обнаружения мутаций и полиморфизмов с использованием методов нуклеазы несовпадения заключается в том, что не требуется никаких предварительных знаний о природе мутации, в отличие от других методов, таких как полиморфизм длины рестрикционного фрагмента (RFLP), который ранее использовался для анализа SNP.

По сравнению с методами, основанными на температуре плавления, методы с использованием эндонуклеаз, специфичных для несоответствия, не только быстрее, но также могут обнаруживать множественные мутации в больших фрагментах ДНК.

Этот метод можно использовать в высокопроизводительных системах с автоматическим впрыском, что делает его пригодным для скрининга.[7]

Преимущества сюрвейерской нуклеазы

Нуклеаза Surveyor является достаточно чувствительным ферментом, продуцирующим поддающиеся обнаружению продукты расщепления из последовательностей, представляющих лишь небольшую часть ДНК в популяции. Он может определять соотношение гетеродуплекса к гомодуплексу 1:32 для меньших продуктов ПЦР (~ 0,6 т.п.н.) и гетеродуплекса к гомодуплексу 1:16 для более длинных продуктов ПЦР (~ 2,3 т.п. Это свойство позволяет бассейн клинических образцов, чтобы увеличить образование гетеродуплекса и, следовательно, чувствительность.[3] Это также полезно для обнаружения минорных вариантов в гетерогенной популяции (например, в гетерогенной опухоли). В случае редактирования генома с помощью CRISPR или других методов это свойство может улучшить обнаружение редких событий редактирования в популяции клеток до создания и тестирования отдельных отредактированных клонов.

Нуклеаза Surveyor расщепляет все типы несовпадений, даже если некоторые из них более предпочтительны, чем другие: CT, AC и CC в равной степени предпочтительнее TT, за ними следуют AA и GG, и, наконец, следуют наименее предпочтительные AG и GT. Он также обнаруживает Indels до не менее 12 п.н.[2]

Анализ нуклеазы Surveyor может также обнаружить множественные мутации в одном и том же фрагменте. Однако для этого требуется несколько дополнительных этапов обработки, которые также могут увеличить фон анализа (см. Ограничения).

Ограничения

Продукт амплификации ПЦР

Одним из основных ограничений этого анализа является то, что он основан на амплификации ПЦР, и поэтому на него влияет качество амплифицированного продукта. Артефакты ПЦР (например, димеры праймеров или усеченные продукты) могут увеличивать фоновый шум и скрывать сигнал. Праймеры-димеры также могут ингибировать активность нуклеазы инспектора, снижая сигнал.

Поскольку метод ПЦР может вносить собственные мутации во время амплификации, эти ошибки также могут увеличивать фоновый шум. Поэтому лучше всего использовать полимеразу высокой точности, чтобы минимизировать ошибки амплификации.

Анализ митохондриальной ДНК может быть подвержен загрязнению последовательностями ядерной митохондриальной ДНК, коамплифицированными во время реакции ПЦР, что затрудняет анализ гомоплазматической митохондриальной ДНК по сравнению с гетероплазматической.[8]

Чтобы обнаружить несколько мутаций в одном и том же фрагменте, необходимо провести очистку после ПЦР до расщепления Surveyor нуклеазой. Обнаружение множественных несовпадений также может быть улучшено за счет увеличения времени и количества нуклеазы инспектора в реакции, но это также увеличивает фон из-за неспецифического расщепления.

Ограничения фермента нуклеазы инспектора

Нуклеаза Surveyor также обладает 5'-экзонуклеазной активностью, которая атакует концы двухцепочечной ДНК, увеличивая фоновый сигнал во время продолжительной инкубации.[2] Это можно уменьшить, сократив время переваривания и добавив ДНК-полимеразу.

Приложения

Подтверждение модификаций генома с помощью CRISPR и других методов

В последние годы появился ряд технологий редактирования генома, в том числе нуклеазы цинковых пальцев (ZFN), эффекторные нуклеазы, подобные активатору транскрипции (ТАЛЕНЫ ) и управляемая РНК CRISPR / Cas9 нуклеазная система. Эти методы способствуют редактированию генома путем введения двухцепочечного разрыва ДНК с последующим восстановлением с помощью путей негомологичного соединения концов (NHEJ) или гомологически-направленной репарации (HDR). В то время как HDR, как ожидается, внесет последовательную модификацию в геном, NHEJ может внести гетерогенный набор мутаций (обычно небольшие вставки), которые будет сложно идентифицировать с помощью секвенирования по Сэнгеру. Точечные мутации и инделки могут быть обнаружены с помощью анализа нуклеазы инспектора, что делает его полезным для обнаружения редактирования генома в пуле клеток без необходимости клональной экспансии до анализа, а также может обеспечить оценку достигнутой эффективности нацеливания.[9][10][11] Даже после клональной экспансии обнаружение мутаций с использованием последовательности Сэнгера может быть затруднительным, поскольку каждый аллель может подвергаться отдельному событию редактирования. В этом случае анализ нуклеазы Surveyor будет фактически использовать этот эффект для создания необходимых гетеродуплексов для обнаружения эндонуклеазой несовпадения.

Обнаружение мутаций зародышевой линии в генах человека

Сюрвейерский анализ нуклеазы был использован для обнаружения мутации зародышевой линии в генах человека. Например, ATRX для Х-связанной умственной отсталости,[12] и ген HBB, связанный с β-талассемией.[7] Анализ также использовался для обнаружения мутаций митохондриальной и ядерной ДНК, связанных с дефектами дыхательной цепи,[13] и мутации, связанные с заболеванием почек.[14][15]

Обнаружение соматических мутаций при раке

Сюрвейерский анализ нуклеазы был использован для обнаружения соматические мутации в различных гены, связанные с раком, и, как указано выше, может использоваться, даже если образец неоднороден и мутантный аллель составляет только 1–5% от общего числа аллелей.[16] Метод был использован для обнаружения мутаций в рецептор эпидермального фактора роста (EGFR),[16][17][18][19] Янус Киназа 2 (JAK2),[20][21] p53 [22] и другие.

Другие приложения

Метод использовался для обнаружения мутаций, вызывающих лекарственную устойчивость у Микобактерии туберкулеза.[23]

Рекомендации

  1. ^ а б c d Ян, Б .; Wen, X .; Kodali, N. S .; Oleykowski, C.A .; Miller, C.G .; Кулински, Дж .; Besack, D .; Yeung, J. A .; Ковальский, Д. (2000-04-04). «Очистка, клонирование и характеристика нуклеазы CEL I». Биохимия. 39 (13): 3533–3541. Дои:10.1021 / bi992376z. ISSN  0006-2960. PMID  10736152.
  2. ^ а б c d е ж Цю, Питер; Шандилья, Харини; Д'Алессио, Джеймс М .; О'Коннор, Кевин; Дурошер, Джеффри; Джерард, Гэри Ф. (2004-04-01). «Обнаружение мутации с помощью нуклеазы Surveyor». Биотехнологии. 36 (4): 702–707. Дои:10.2144 / 04364PF01. ISSN  0736-6205. PMID  15088388.
  3. ^ а б c d Юнг, Энтони Т .; Хаттангади, Дипали; Блейксли, Лорин; Николя, Эммануэль (01.05.2005). «Технологии обнаружения ферментативных мутаций». Биотехнологии. 38 (5): 749–758. Дои:10.2144 / 05385rv01. ISSN  0736-6205. PMID  15948293.
  4. ^ Хуанг, Мо Чао; Чеонг, Вай Чье; Лим, Ли Ши; Ли, Мо-Хуан (01.03.2012). «Простой высокочувствительный скрининг мутаций с использованием эндонуклеазы I Т7, опосредованной амплигазой, и нуклеазы Surveyor с микрофлюидным капиллярным электрофорезом». Электрофорез. 33 (5): 788–796. Дои:10.1002 / elps.201100460. ISSN  1522-2683. PMID  22437793.
  5. ^ а б c Олейковский, Екатерина А .; Маллинз, Коллин РБ; Годвин, Эндрю К; Йунг, Энтони Т (1998). «Обнаружение мутации с использованием новой эндонуклеазы растений». Исследования нуклеиновых кислот. 26 (20): 4597–4602. Дои:10.1093 / nar / 26.20.4597. ЧВК  147896. PMID  9753726.
  6. ^ Кулински, Дж .; Besack, D .; Oleykowski, C.A .; Годвин, А. К .; Йунг, А. Т. (2000-07-01). «Анализ ферментативной мутации CEL I». Биотехнологии. 29 (1): 44–46, 48. Дои:10.2144 / 00291bm07. ISSN  0736-6205. PMID  10907074.
  7. ^ а б Хунг, Чиа-Ченг; Су, И-Нин; Линь, Чиа-Юнь; Чанг, Инь-Фэй; Чанг, Цзянь-Хуэй; Ченг, Вэнь-Фанг; Чен, Чи-Ань; Ли, Чиен-Нан; Линь, Вин-Ли (01.01.2008). «Сравнение метода эндонуклеаз, специфичных для несоответствия, и денатурирующей высокоэффективной жидкостной хроматографии для идентификации мутаций гена HBB». BMC Biotechnology. 8: 62. Дои:10.1186/1472-6750-8-62. ISSN  1472-6750. ЧВК  2525636. PMID  18694524.
  8. ^ Йен, Сю-Чуань; Ли, Шиуэ-Ли; Сюй, Вэй-Цзянь; Тан, Петрус (01.01.2014). «Вмешательство коамплифицированных последовательностей ядерной митохондриальной ДНК в определение гетероплазмии мтДНК человека с использованием нуклеазы SURVEYOR и системы WAVE HS». PLOS ONE. 9 (3): e92817. Bibcode:2014PLoSO ... 992817Y. Дои:10.1371 / journal.pone.0092817. ISSN  1932-6203. ЧВК  3963942. PMID  24664244.
  9. ^ Гущин, Дмитрий Ю .; Уэйт, Адам Дж .; Katibah, George E .; Миллер, Джеффри С.; Холмс, Майкл С .; Арбар, Эдвард Дж. (01.01.2010). «Быстрый и общий анализ для мониторинга модификации эндогенного гена». Методы молекулярной биологии. 649: 247–256. Дои:10.1007/978-1-60761-753-2_15. ISBN  978-1-60761-752-5. ISSN  1940-6029. PMID  20680839.
  10. ^ Ран, Ф. Энн; Сюй, Патрик Д .; Линь, Чи-Ю; Гутенберг, Джонатан С .; Конерманн, Сильвана; Trevino, Alexandro E .; Скотт, Дэвид А .; Иноуэ, Азуса; Матоба, Сёго (12 сентября 2013 г.). «Двойное проникновение с помощью CRISPR Cas9 под управлением РНК для повышения специфичности редактирования генома». Клетка. 154 (6): 1380–1389. Дои:10.1016 / j.cell.2013.08.021. ISSN  1097-4172. ЧВК  3856256. PMID  23992846.
  11. ^ Ван, Хаойи; Ян, Хуэй; Шивалила, Чикду С .; Dawlaty, Meelad M .; Ченг, Альберт В .; Чжан, Фэн; Яениш, Рудольф (09.05.2013). «Одношаговое создание мышей, несущих мутации в нескольких генах, с помощью CRISPR / Cas-опосредованной геномной инженерии». Клетка. 153 (4): 910–918. Дои:10.1016 / j.cell.2013.04.025. ISSN  1097-4172. ЧВК  3969854. PMID  23643243.
  12. ^ Вада, Такахито; Фукусима, Йошимицу; Сайто, Синдзи (15.07.2006). «Новый метод обнаружения мутаций гена ATRX с использованием эндонуклеазы, специфичной для несоответствия». Американский журнал медицинской генетики, часть A. 140 (14): 1519–1523. Дои:10.1002 / ajmg.a.31310. ISSN  1552-4825. PMID  16763962.
  13. ^ Баннварт, Сильви; Прокаччо, Винсент; Паки-Флюклингер, Вероник (01.06.2005). «Surveyor Nuclease: новая стратегия для быстрой идентификации гетероплазматических мутаций митохондриальной ДНК у пациентов с дефектами дыхательной цепи». Человеческая мутация. 25 (6): 575–582. Дои:10.1002 / humu.20177. ISSN  1098-1004. PMID  15880407.
  14. ^ Тан, Инь-Цай; Блюменфельд, Джон Д .; Ангел, Ралука; Донахью, Стефани; Беленькая, Римма; Балина, Марина; Паркер, Томас; Левин, Дэниел; Леонард, Дебра Г. Б. (01.02.2009). «Новый метод геномного анализа мутаций PKD1 и PKD2 при аутосомно-доминантной поликистозной болезни почек». Человеческая мутация. 30 (2): 264–273. Дои:10.1002 / humu.20842. ISSN  1098-1004. PMID  18837007.
  15. ^ Воскаридес, Константинос; Дельтас, Константинос (01.07.2009). «Скрининг мутаций в генах, связанных с почками, с использованием нуклеазы SURVEYOR для расщепления при несовпадении гетеродуплексов». Журнал молекулярной диагностики. 11 (4): 311–318. Дои:10.2353 / jmoldx.2009.080144. ISSN  1943-7811. ЧВК  2710707. PMID  19525337.
  16. ^ а б Энгельман, Джеффри А .; Мукохара, Тору; Зейнуллаху, Крешник; Лифшиц, Евгений; Borrás, Ana M .; Гейл, Кристофер-Майкл; Наумов Георгий Н .; Yeap, Beow Y .; Джаррелл, Эмили (01.10.2006). «Аллельное разведение затрудняет обнаружение биологически значимой мутации устойчивости при раке легкого, усиленном EGFR». Журнал клинических исследований. 116 (10): 2695–2706. Дои:10.1172 / JCI28656. ISSN  0021-9738. ЧВК  1570180. PMID  16906227.
  17. ^ Джекман, Дэвид М .; Холмс, Элисон Дж .; Линдеман, Нил; Вен, Патрик Ю.; Кесари, Сантош; Боррас, Ана М .; Бейли, Кристофер; де Йонг, Франциска; Янне, Паси А. (20 сентября 2006 г.). «Ответ и резистентность у пациента с немелкоклеточным раком легкого с мутацией рецептора эпидермального фактора роста и лептоменингеальными метастазами, получавшими высокие дозы гефитиниба». Журнал клинической онкологии. 24 (27): 4517–4520. Дои:10.1200 / JCO.2006.06.6126. ISSN  1527-7755. PMID  16983123.
  18. ^ Джекман, Дэвид М .; Yeap, Beow Y .; Sequist, Lecia V .; Линдеман, Нил; Холмс, Элисон Дж .; Джоши, Виктория А .; Белл, Дафна В .; Huberman, Mark S .; Халмос, Балаж (01.07.2006). «Мутации с делецией экзона 19 рецептора эпидермального фактора роста связаны с длительным выживанием у пациентов с немелкоклеточным раком легкого, получавших гефитиниб или эрлотиниб». Клинические исследования рака. 12 (13): 3908–3914. Дои:10.1158 / 1078-0432.CCR-06-0462. ISSN  1078-0432. PMID  16818686.
  19. ^ Jänne, Pasi A .; Боррас, Ана М .; Куанг, Яньань; Роджерс, Эндрю М .; Джоши, Виктория А .; Лиянаге, Хема; Линдеман, Нил; Ли, Джеффри С.; Халмос, Балаж (01.02.2006). «Быстрый и чувствительный ферментативный метод скрининга мутаций рецептора эпидермального фактора роста». Клинические исследования рака. 12 (3 Pt 1): 751–758. Дои:10.1158 / 1078-0432.CCR-05-2047. ISSN  1078-0432. PMID  16467085.
  20. ^ Jamieson, Catriona H.M .; Готлиб, Джейсон; Durocher, Jeffrey A .; Чао, Марк П .; Мариаппан, М. Раджан; Лэй, Марла; Джонс, Кэрол; Zehnder, James L .; Лиллеберг, Стэн Л. (18 апреля 2006 г.). «Мутация JAK2 V617F встречается в гемопоэтических стволовых клетках при истинной полицитемии и предрасполагает к дифференцировке эритроидов». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 103 (16): 6224–6229. Bibcode:2006PNAS..103.6224J. Дои:10.1073 / pnas.0601462103. ISSN  0027-8424. ЧВК  1434515. PMID  16603627.
  21. ^ Саттлер, Мартин; Вальц, Кристоф; Кроули, Брайан Дж .; Ленгфельдер, Ева; Jänne, Pasi A .; Роджерс, Эндрю М .; Куанг, Яньань; Дистел, Роберт Дж .; Рейтер, Андреас (01.02.2006). «Чувствительный высокопроизводительный метод обнаружения активирующих мутаций Jak2 в образцах периферической крови». Кровь. 107 (3): 1237–1238. Дои:10.1182 / кровь-2005-07-2899. ISSN  0006-4971. ЧВК  1895916. PMID  16434495.
  22. ^ Митани, Нориаки; Нива, Йошимаса; Окамото, Ясуюки (01.11.2007). «Обнаружение мутаций гена p53 при гематологических злокачественных новообразованиях на основе Surveyor нуклеаз». Анналы клинической биохимии. 44 (Pt 6): 557–559. Дои:10.1258/000456307782268174. ISSN  0004-5632. PMID  17961311.
  23. ^ Ши, Руиру; Отомо, Кодзи; Ямада, Хироюки; Тацуми, Тайга; Сугавара, Исаму (01.01.2006). «Температурный гетеродуплексный анализ для обнаружения мутаций гена устойчивости к лекарствам в клинических изолятах Mycobacterium tuberculosis с помощью денатурирующей ВЭЖХ, нуклеазы SURVEYOR». Микробы и инфекции / Institut Pasteur. 8 (1): 128–135. Дои:10.1016 / j.micinf.2005.06.008. ISSN  1286-4579. PMID  16182590.