ХОЛОДНАЯ ПЦР - COLD-PCR

ХОЛОДНАЯ ПЦР (co-усиление на лцветущий dтемпература насыщенияПЦР) является модифицированным Полимеразной цепной реакции (ПЦР) протокол, который обогащает вариант аллели из смеси дикого типа и мутация -содержащий ДНК. Способность преимущественно амплифицировать и идентифицировать миноритарные аллели и аллели низкого уровня соматический Мутации ДНК в присутствии избыточных аллелей дикого типа полезны для обнаружения мутаций. Обнаружение мутаций важно в случае раннего рак обнаружение от ткань биопсия и биологические жидкости, такие как плазма крови или же сыворотка, оценка остаточного болезнь после хирургия или же химиотерапия определение стадий заболевания и молекулярное профилирование для прогноза или индивидуального подхода к терапии для отдельных пациентов, а также мониторинг результатов терапии и ремиссии или рецидива рака. Обычная ПЦР будет амплифицировать как основной (дикий тип), так и минорный (мутантный) аллели с одинаковой эффективностью, перекрывая способность легко обнаруживать наличие мутаций низкого уровня. Способность обнаруживать мутацию в смеси вариантной ДНК / ДНК дикого типа ценна, потому что эта смесь вариантной ДНК может возникнуть при использовании гетерогенного образца - как это часто бывает с биопсией рака. В настоящее время традиционная ПЦР используется в тандеме с рядом различных последующих анализов для генотипирование или обнаружение соматический мутации. Они могут включать использование амплифицированной ДНК для RFLP анализ, МАЛДИ-ТОФ (матричная лазерная десорбция - время пролета) генотипирование или прямое секвенирование для обнаружения мутаций с помощью Секвенирование по Сэнгеру или же пиросеквенирование. Замена традиционной ПЦР на ХОЛОДНУЮ ПЦР для этих последующих анализов повысит надежность обнаружения мутаций в смешанных образцах, включая опухоли и биологические жидкости.

Обзор метода COLD-PCR

Обзор ХОЛОДНОЙ ПЦР по сравнению с обычной ПЦР.
Обычная ПЦР по сравнению с ХОЛОДНОЙ ПЦР.

Основным принципом ХОЛОДНОЙ ПЦР является то, что один нуклеотид несовпадения будут немного изменять температуру плавления (Tm) двухцепочечной ДНК. В зависимости от контекста последовательности и положения несоответствия Tm изменяется на 0,2–1,5 ° C (0,36–2,7 ° F). обычны для последовательностей до 200 пар оснований и выше. Зная это, авторы протокола воспользовались двумя наблюдениями:

  • Каждая двухцепочечная ДНК имеет «критическую температуру» (Tc) ниже, чем ее Tm. Эффективность ПЦР-амплификации заметно падает ниже Tc.
  • Tc зависит от последовательности ДНК. Два фрагмента матричной ДНК, отличающиеся только одним или двумя несовпадениями нуклеотидов, будут иметь разную эффективность амплификации, если этап денатурации ПЦР установлен на Tc.

Принимая во внимание эти принципы, авторы разработали следующий общий протокол:

  1. Стадия денатурации. ДНК денатурируется при высокой температуре - обычно 94 ° C (201 ° F).
  2. Стадия промежуточного отжига. Установите промежуточную температуру отжига, которая позволяет гибридизовать мутантную и аллельную ДНК дикого типа друг с другом. Поскольку мутантная аллельная ДНК образует меньшую часть ДНК в смеси, они с большей вероятностью образуют несовпадающую гетеродуплексную ДНК с ДНК дикого типа.
  3. Стадия плавления. Эти гетеродуплексы легче плавятся при более низких температурах. Следовательно, они избирательно денатурируют при Tc.
  4. Этап отжига праймера. Гомодуплексная ДНК будет предпочтительно оставаться двухцепочечной и не будет доступна для отжига праймеров.
  5. Этап продления. ДНК-полимераза будет расширяться комплементарно матричной ДНК. Поскольку гетеродуплексная ДНК используется в качестве матрицы, большая часть минорной вариантной ДНК будет амплифицирована и доступна для последующих раундов ПЦР.

На сегодняшний день разработаны две формы COLD-PCR. Полная ХОЛОДНАЯ ПЦР и Быстрая ХОЛОДНАЯ ПЦР.

Обзор полной ХОЛОДНОЙ ПЦР по сравнению с быстрой ХОЛОДНОЙ ПЦР.
Полная ХОЛОДНАЯ ПЦР против быстрой ХОЛОДНОЙ ПЦР.

Полная ХОЛОДНАЯ ПЦР

Полная COLD-PCR идентична протоколу, описанному выше. Эти пять ступеней используются для каждого раунда усиления.

Быстрая COLD-PCR

Быстрая COLD-PCR отличается от Full COLD-PCR тем, что пропускаются стадии денатурации и промежуточного отжига. Это связано с тем, что в некоторых случаях предпочтительная амплификация мутантной ДНК настолько велика, что обеспечение образования гетеродуплексной ДНК мутантного / дикого типа не требуется. Таким образом, денатурация может происходить на Tc, переходить к отжигу праймеров и затем к удлинению, опосредованному полимеразой. Каждый раунд усиления будет включать эти три стадии в указанном порядке. При использовании более низкой температуры денатурации реакция будет различать продукты с более низкой Tm, то есть вариантные аллели. Быстрая ХОЛОДНАЯ ПЦР дает намного более быстрые результаты из-за сокращенного протокола. Однако важно отметить, что полная ХОЛОДНАЯ ПЦР необходима для амплификации всех возможных мутаций в исходной смеси ДНК.

Двухэтапная COLD-PCR - это модифицированная версия Fast COLD-PCR. Во втором раунде быстрой COLD-PCR используются вложенные праймеры. Это повышает чувствительность обнаружения мутаций по сравнению с быстрой ХОЛОДНОЙ ПЦР за один цикл.[1]

Использование COLD-PCR на сегодняшний день

ХОЛОДНАЯ ПЦР использовалась для повышения надежности ряда различных анализов, в которых традиционно используется обычная ПЦР.

Некоторые последующие приложения для COLD-PCR.
Последующие приложения, использующие обычную ПЦР, которую можно заменить на COLD-PCR.

ПДРФ и ХОЛОДНАЯ ПЦР

Полиморфизм длины рестрикционного фрагмента приводит к расщеплению (или его отсутствию) ДНК для конкретной мутации выбранным рестрикционным ферментом, который не будет расщеплять ДНК дикого типа. В исследовании с использованием смеси дикого типа и мутации, содержащей ДНК, амплифицированную с помощью обычной ПЦР или ХОЛОДНОЙ ПЦР, было показано, что ХОЛОДНАЯ ПЦР перед анализом ПДРФ улучшает обнаружение мутаций в 10-20 раз.[2]

Секвенирование по Сэнгеру и ХОЛОДНАЯ ПЦР

Секвенирование по Сэнгеру недавно было использовано для оценки обогащения мутантной ДНК из смеси 1:20 мутант: ДНК дикого типа. Вариант ДНК, содержащий мутацию, был получен из рак молочной железы известная клеточная линия, содержащая p53 мутации.[1] Сравнение хроматограмм секвенирования по Сэнгеру показало, что мутантный аллель был обогащен в 13 раз при использовании COLD-PCR по сравнению с одной традиционной PCR.[1] Это определялось размером пиков на хроматограмме в месте расположения вариантного аллеля.

Кроме того, COLD-PCR использовалась для обнаружения мутаций p53 в легких.аденокарцинома образцы. В ходе исследования было обнаружено 8 мутаций низкого уровня (менее 20%), которые, вероятно, были бы пропущены при использовании обычных методов, которые не обогащают вариантную последовательность ДНК.

Пиросеквенирование и COLD-PCR

Было показано, что, как и при прямом секвенировании по Сэнгеру, с пиросеквенированием ХОЛОДНАЯ ПЦР способна обнаруживать мутации, которые имели распространенность 0,5-1% от используемых образцов.[3] COLD-PCR использовался для обнаружения мутаций p53 и KRAS посредством пиросеквенирования, и было показано, что он превосходит стандартную PCR в обоих случаях.

MALDI-TOF и COLD-PCR

Та же исследовательская группа, которая разработала COLD-PCR и использовала ее для сравнения чувствительности обычной PCR для генотипирования с прямым секвенированием по Сэнгеру, RFLP и пиросеквенированием, также провела аналогичное исследование с использованием MALDI-TOF в качестве приложения для обнаружения мутаций. Их результаты показали, что COLD-PCR может обогатить последовательности мутаций из смеси ДНК в 10-100 раз и что мутации с начальной распространенностью 0,1-0,5% будут обнаруживаться.[4] По сравнению с ожидаемым уровнем детекции низкого уровня 5-10% при традиционной ПЦР.

QPCR и COLD-PCR

ХОЛОДНАЯ ПЦР запускается на количественная ПЦР машина, используя TaqMan Было показано, что зонды, специфичные для мутации, увеличивают измеряемую разницу между образцами мутантного и дикого типов.[4]

Преимущества COLD-PCR

  • Одношаговый метод, позволяющий обогатить как известные, так и неизвестные миноритарные аллели, независимо от типа и положения мутации.
  • Не требует дополнительных реагентов или специального оборудования. Поэтому стоимость не увеличивается.
  • Лучше, чем обычная ПЦР для обнаружения мутаций в смешанном образце.
  • Не увеличивает значительно время проведения эксперимента по сравнению с обычной ПЦР.

Недостатки COLD-PCR

  • Оптимальная Tc должна быть измерена и определена для каждого ампликона. Добавление дополнительного шага к обычным процедурам на основе ПЦР.
  • Требование точного контроля температуры денатурации во время ПЦР с точностью до ± 0,3 ° C (0,54 ° F).
  • Подходящая критическая температура может быть недоступна, чтобы различать мутантные последовательности ДНК и последовательности ДНК дикого типа.
  • Только для анализа последовательностей размером менее 200 пар оснований.
  • Уязвим к ошибкам, связанным с полимеразой.
  • Переменное общее количество мутаций, которое зависит от положения ДНК и замены нуклеотидов.
  • Нет гарантии, что все мутации низкого уровня будут преимущественно обогащены.

История

COLD-PCR был первоначально описан Ли и другие. в статье Nature Medicine, опубликованной в 2008 году лабораторией доктора Майка Макригиоргоса в Онкологическом институте Даны Фарбер Гарвардской медицинской школы.[2] Как резюмировано выше, технология использовалась в ряде экспериментальных экспериментов и медицинских исследовательских диагностических экспериментов.

Недавно технология COLD-PCR была лицензирована Transgenomic, Inc. Условия лицензирования включают исключительные права на коммерциализацию технологии в сочетании с секвенированием по Сэнгеру. В планах - разработка коммерческих приложений, которые позволят быстро и с высокой чувствительностью обнаруживать низкоуровневые соматические и митохондриальные мутации ДНК.[5]

Альтернативы

Доступны другие технологии для обнаружения меньших мутаций ДНК, и эти методы могут быть разделены по их способности обогащать и обнаруживать известные или неизвестные мутации.[6]

В таблице приведены некоторые альтернативы ХОЛОДНОЙ ПЦР.
Альтернативы COLD-PCR. COLD-PCR имеет селективность 10−1 до 10−4

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ а б c Ли Дж., Милбери, Калифорния, Ли С., Макригиоргос, GM (ноябрь 2009 г.). «Двухэтапное секвенирование по Сэнгеру на основе COLD-PCR идентифицирует новый спектр низкоуровневых мутаций в аденокарциноме легких». Человеческая мутация. 30 (11): 1583–90. Дои:10.1002 / humu.21112. ЧВК  2784016. PMID  19760750.
  2. ^ а б Ли Дж, Ван Л, Мамон Х, Кульке М.Х., Бербеко Р., Макригиоргос Г.М. (май 2008 г.). «Замена ПЦР на ХОЛОДНУЮ ПЦР обогащает вариантные последовательности ДНК и переопределяет чувствительность генетического тестирования». Природа Медицина. 14 (5): 579–84. Дои:10,1038 / нм1708. PMID  18408729.
  3. ^ Zuo Z, Chen SS, Chandra PK, et al. (Август 2009 г.). «Применение COLD-PCR для улучшенного обнаружения мутаций KRAS в клинических образцах». Современная патология. 22 (8): 1023–31. Дои:10.1038 / modpathol.2009.59. PMID  19430420.
  4. ^ а б Ли Дж., Макригиоргос GM (апрель 2009 г.). «COLD-PCR: новая платформа для улучшенного обнаружения мутаций при онкологических и генетических исследованиях». Сделки Биохимического Общества. 37 (2): 427–32. Дои:10.1042 / BST0370427. PMID  19290875.
  5. ^ Редакционная коллегия Laboratorytalk (октябрь 2009 г.). «Трансгеномика лицензирует технологию ХОЛОДНОЙ ПЦР». Архивировано из оригинал на 2011-07-18. Получено 2010-03-04.
  6. ^ Милбери, Калифорния, Ли Дж., Макригиоргос, GM (апрель 2009 г.). «Методы на основе ПЦР для обогащения миноритарных аллелей и мутаций». Клиническая химия. 55 (4): 632–40. Дои:10.1373 / Clinchem.2008.113035. ЧВК  2811432. PMID  19201784.