Полимеразная цепная реакция с удлинением перекрытия - Overlap extension polymerase chain reaction
 | Эта статья нужны дополнительные цитаты для проверка. (Февраль 2018 г.) (Узнайте, как и когда удалить этот шаблон сообщения) |
В полимеразная цепная реакция удлинения перекрытия (или же OE-PCR) является вариантом ПЦР. Его также называют Сращивание путем расширения внахлест / Сплайсинг методом ПЦР с удлинением выступа (SOE). Он используется для вставки конкретных мутации в определенных точках последовательности или для сращивания меньших фрагментов ДНК в более крупные полинуклеотид.[1]
Сплайсинг молекул ДНК
Как и в большинстве реакций ПЦР, для каждой последовательности используются два праймера - по одному для каждого конца. Для сращивания двух молекул ДНК используются специальные праймеры на концах, которые необходимо соединить. Для каждой молекулы праймер на конце, который должен быть соединен, сконструирован таким образом, что он имеет 5'-выступ, комплементарный концу другой молекулы. После отжига при репликации ДНК удлиняется новой последовательностью, комплементарной молекуле, к которой она должна быть присоединена. Как только обе молекулы ДНК удлиняются таким образом, они смешиваются, и ПЦР проводится только с праймерами для дальних концов. Введенные перекрывающиеся комплементарные последовательности будут служить праймерами, и две последовательности будут слиты. Этот метод имеет преимущество перед другими методами сплайсинга генов, поскольку не требует сайтов рестрикции.
Для получения более высоких урожаев некоторые грунтовки используются в избытке, как в асимметричная ПЦР.
Введение мутаций
Чтобы вставить мутацию в последовательность ДНК, конкретный грунтовка разработан. Праймер может содержать единственную замену или новую последовательность на своем 5'-конце. Если удаление требуется, добавляется последовательность, составляющая 5 'от делеции, поскольку 3' конец праймера должен иметь комплементарность цепи матрицы, чтобы праймер мог в достаточной степени отжиг к матричной ДНК.
После отжига праймера на шаблоне Репликация ДНК переходит к концу шаблона. Дуплекс денатурируется, и второй праймер отжигается с вновь образованной цепью ДНК, содержащей последовательность из первого праймера. Репликация продолжается для создания цепи требуемой последовательности, содержащей мутацию.
Дуплекс снова денатурируется, и теперь первый праймер может связываться с последней цепью ДНК. Реакция репликации продолжает давать полностью димеризованный Фрагмент ДНК. После дополнительных циклов ПЦР для амплификации ДНК образец можно разделить электрофорез в агарозном геле с последующей электроэлюцией для сбора.
Эффективно генерируя олигонуклеотиды длиной более ~ 110 нуклеотидов очень сложно, поэтому для вставки мутации дальше в последовательность, чем позволяет праймер 110 нуклеотидов, необходимо использовать ПЦР с перекрывающимся удлинением. В OE-PCR модифицируемая последовательность используется для создания двух модифицированных цепей с мутацией на противоположных концах, используя метод, описанный выше. После смешивания и денатурации нити подвергаются отжигу для получения трех различных комбинаций, как показано на диаграмме. Только дуплекс без перекрытия на 5'-конце допускает удлинение ДНК-полимеразой в направлении от 3 'до 5'.
После разделения элюированные фрагменты подходящего размера подвергают нормальной ПЦР с использованием внешних праймеров, используемых в начальных мутагенных реакциях ПЦР.
Рекомендации
- ^ Хигучи Р., Краммель Б., Сайки Р. (1988). "Общий метод in vitro подготовка и специфический мутагенез фрагментов ДНК: изучение взаимодействия белков и ДНК ». Нуклеиновые кислоты Res. 16 (15): 7351–67. Дои:10.1093 / nar / 16.15.7351. ЧВК 338413. PMID 3045756.
