Обратная полимеразная цепная реакция - Inverse polymerase chain reaction
Эта статья включает в себя список общих Рекомендации, но он остается в основном непроверенным, потому что ему не хватает соответствующих встроенные цитаты.Апрель 2012 г.) (Узнайте, как и когда удалить этот шаблон сообщения) ( |
Обратная полимеразная цепная реакция (Обратная ПЦР) является вариантом полимеразной цепной реакции что используется для усиления ДНК только с одной известной последовательностью. Одним из ограничений традиционной ПЦР является то, что она требует грунтовки дополняет оба Термини ДНК-мишени, но этот метод позволяет проводить ПЦР, даже если доступна только одна последовательность, из которой могут быть созданы праймеры.
Обратная ПЦР особенно полезна для определения вставлять локации. Например, различные ретровирусы и транспозоны случайным образом интегрировать в геномная ДНК.[1] Чтобы идентифицировать сайты, в которые они вошли, известные «внутренние» вирусные или транспозонные последовательности можно использовать для создания праймеров, которые будут амплифицировать небольшую часть фланкирующей «внешней» геномной ДНК. Затем амплифицированный продукт можно секвенировать и в сравнении с базами данных ДНК, чтобы найти последовательность, которая была нарушена.
Метод обратной ПЦР включает в себя серию ограничительные дайджесты и перевязка, в результате чего получается петлевой фрагмент, который можно праймировать для ПЦР из одного участка известной последовательности. Затем, как и другие процессы полимеразной цепной реакции, ДНК амплифицируется чувствительным к температуре ДНК-полимераза:
- Идентифицируется целевая область с внутренним участком известной последовательности и неизвестными фланкирующими областями.
- Геномная ДНК расщепляется на фрагменты нескольких килобазы обычно с низкой-средней частотой (6-8 оснований) рестрикционный фермент.
- При низких концентрациях ДНК индуцируется самолигирование с образованием кольцевого продукта ДНК.
- ПЦР проводится как обычно, с праймерами, комплементарными участкам известной внутренней последовательности. *
Наконец, последовательность сравнивается с последовательностью, доступной в базе данных, и используется в случае обхода хромосом.
- Примечание: хотя рисунок показывает, что циркулярный продукт лигирования расщепляется до ПЦР, это не так. ПЦР не требует линейных продуктов, и использование другого рестрикционного фермента для разрезания известной последовательности также может разрезать в неизвестной области, что приводит к неудачной ПЦР.