Обратная полимеразная цепная реакция - Inverse polymerase chain reaction

Резюме процесса обратной ПЦР.

Обратная полимеразная цепная реакция (Обратная ПЦР) является вариантом полимеразной цепной реакции что используется для усиления ДНК только с одной известной последовательностью. Одним из ограничений традиционной ПЦР является то, что она требует грунтовки дополняет оба Термини ДНК-мишени, но этот метод позволяет проводить ПЦР, даже если доступна только одна последовательность, из которой могут быть созданы праймеры.

Обратная ПЦР особенно полезна для определения вставлять локации. Например, различные ретровирусы и транспозоны случайным образом интегрировать в геномная ДНК.[1] Чтобы идентифицировать сайты, в которые они вошли, известные «внутренние» вирусные или транспозонные последовательности можно использовать для создания праймеров, которые будут амплифицировать небольшую часть фланкирующей «внешней» геномной ДНК. Затем амплифицированный продукт можно секвенировать и в сравнении с базами данных ДНК, чтобы найти последовательность, которая была нарушена.

Метод обратной ПЦР включает в себя серию ограничительные дайджесты и перевязка, в результате чего получается петлевой фрагмент, который можно праймировать для ПЦР из одного участка известной последовательности. Затем, как и другие процессы полимеразной цепной реакции, ДНК амплифицируется чувствительным к температуре ДНК-полимераза:

  1. Идентифицируется целевая область с внутренним участком известной последовательности и неизвестными фланкирующими областями.
  2. Геномная ДНК расщепляется на фрагменты нескольких килобазы обычно с низкой-средней частотой (6-8 оснований) рестрикционный фермент.
  3. При низких концентрациях ДНК индуцируется самолигирование с образованием кольцевого продукта ДНК.
  4. ПЦР проводится как обычно, с праймерами, комплементарными участкам известной внутренней последовательности. *

Наконец, последовательность сравнивается с последовательностью, доступной в базе данных, и используется в случае обхода хромосом.

  • Примечание: хотя рисунок показывает, что циркулярный продукт лигирования расщепляется до ПЦР, это не так. ПЦР не требует линейных продуктов, и использование другого рестрикционного фермента для разрезания известной последовательности также может разрезать в неизвестной области, что приводит к неудачной ПЦР.

Рекомендации

  1. ^ Ochman, H .; Гербер, А. С .; Хартл, Д. Л. (1988-11-01). «Генетические приложения обратной полимеразной цепной реакции». Генетика. 120 (3): 621–623. ISSN  0016-6731. ЧВК  1203539. PMID  2852134.