Полимеразная цепная реакция приземления - Touchdown polymerase chain reaction

В полимеразная цепная реакция приземления или же полимеразная цепная реакция в стиле приземления это метод полимеразной цепной реакции по которому грунтовки избегать амплификации неспецифических последовательностей.[1] В отжиг температура во время полимеразной цепной реакции определяет специфичность отжига праймера. В температура плавления праймера устанавливает верхний предел температуры отжига. При температурах чуть выше этой точки будет происходить только очень специфическое спаривание оснований между праймером и матрицей. При более низких температурах праймеры связываются менее специфично. Неспецифическое связывание праймера скрывает результаты полимеразной цепной реакции, так как неспецифические последовательности, с которыми отжигаются праймеры на ранних этапах амплификации, будут «вытеснять» любые специфические последовательности из-за экспоненциальный природа полимераза усиление.[2]

Метод

Самые ранние стадии цикла полимеразной цепной реакции касания имеют высокие температуры отжига. Температура отжига постепенно снижается для каждого последующего набора циклов. Праймер будет отжигаться при наивысшей температуре, которая в наименьшей степени допускает неспецифическое связывание, которое он способен переносить. Таким образом, первая амплифицированная последовательность находится между областями наибольшей специфичности праймера; скорее всего, это интересующая последовательность. Эти фрагменты будут далее амплифицироваться во время последующих циклов при более низких температурах и будут превосходить неспецифические последовательности, с которыми праймеры могут связываться при этих более низких температурах. Если праймер первоначально (во время высокотемпературных фаз) связывается с интересующей последовательностью, последующие раунды полимеразной цепной реакции могут быть выполнены с продуктом для дальнейшей амплификации этих фрагментов. Приземление увеличивает специфичность реакции при более высоких температурах и увеличивает эффективность ближе к концу за счет снижения температуры отжига.[3]

Рекомендации

  1. ^ Дон Р., Кокс П., Уэйнрайт Б., Бейкер К., Мэттик Дж. (1991). "'ПЦР Touchdown для предотвращения ложного праймирования во время амплификации гена ". Нуклеиновые кислоты Res. 19 (14): 4008. Дои:10.1093 / nar / 19.14.4008. ЧВК  328507. PMID  1861999.
  2. ^ Хеккер К., Ру К. (1996). «Высокие и низкие температуры отжига увеличивают как специфичность, так и выход в результате приземной и ступенчатой ​​ПЦР». Биотехнологии. 20 (3): 478–85. Дои:10.2144/19962003478. PMID  8679209.
  3. ^ Ру К. (1994). «Использование несовпадающих пар праймер-шаблон в Touchdown PCR». Биотехнологии. 16 (5): 812–4. PMID  8068332.