Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией - Reverse transcription polymerase chain reaction

«RT-PCR» перенаправляется сюда. Информацию о полимеразной цепной реакции в реальном времени, также называемой количественной полимеразной цепной реакцией в реальном времени (кПЦР) или кинетической полимеразной цепной реакцией, см. Полимеразная цепная реакция в реальном времени.
ОТ-ПЦР

Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) представляет собой лабораторный метод, сочетающий обратная транскрипция из РНК в ДНК (в этом контексте называется комплементарная ДНК или кДНК) и амплификации конкретных ДНК-мишеней с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР).[1] Он в основном используется для измерения количества конкретной РНК. Это достигается путем мониторинга реакции амплификации с помощью флуоресценции, метода, называемого ПЦР в реальном времени или количественная ПЦР (qPCR). Комбинированная RT-PCR и qPCR обычно используются для анализа экспрессия гена и количественная оценка вирусной РНК в исследованиях и клинических условиях.

Тесная связь между RT-PCR и qPCR привела к метонимический использование термина кПЦР для обозначения ОТ-ПЦР. Такое использование может сбивать с толку,[2] поскольку ОТ-ПЦР может использоваться без КПЦР, например, для включения молекулярное клонирование, последовательность действий или простое обнаружение РНК. И наоборот, qPCR может использоваться без RT-PCR, например, для количественной оценки номер копии определенного фрагмента ДНК.

Номенклатура

Комбинированный метод RT-PCR и qPCR был описан как количественная RT-PCR.[3] или ОТ-ПЦР в реальном времени[4] (иногда даже называется количественной ОТ-ПЦР в реальном времени)[5]), сокращенно обозначается как qRT-PCR,[6] ОТ-КПЦР,[7] ОТ-ПЦР,[8] и рОТ-ПЦР.[9] Во избежание недоразумений в этой статье будут последовательно использоваться следующие сокращения:

ТехникаСокращение
Полимеразной цепной реакцииПЦР
Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипциейОТ-ПЦР
Полимеразная цепная реакция в реальном времениКПЦР
Комбинированный метод RT-PCR / qPCRqRT-PCR

Не все авторы, особенно более ранние, используют это соглашение, и читатель должен быть осторожен при переходе по ссылкам. ОТ-ПЦР использовалась для обозначения как ПЦР в реальном времени (qPCR), так и ПЦР с обратной транскрипцией (RT-PCR).

История

С момента своего появления в 1977 году Нозерн-блот широко используется для количественной оценки РНК, несмотря на свои недостатки: (а) метод, требующий больших затрат времени, (б) требует большого количества РНК для обнаружения, и (в) количественно неточен из-за низкого содержания РНК.[10][11] Однако с момента ее изобретения Кэри Муллис в 1983 году ОТ ПЦР с тех пор вытеснила Нозерн-блоттинг как метод выбора для обнаружения и количественного определения РНК.[12]

ОТ-ПЦР стала эталонной технологией для обнаружения и / или сравнения уровней РНК по нескольким причинам: (а) она не требует обработки после ПЦР, (б) широкий диапазон (> 107-кратное) обилия РНК может быть измерено, и (c) он обеспечивает понимание как качественных, так и количественных данных.[5] Благодаря своей простоте, специфичности и чувствительности ОТ-ПЦР используется в широком диапазоне Приложения из экспериментов так же просто, как количественное определение дрожжевые клетки в вине для более сложных применений в качестве диагностических инструментов для обнаружения инфекционных агентов, таких как Птичий грипп вирус и SARS-CoV-2.[13][14][15]

Принципы

В ОТ-ПЦР РНК шаблон сначала преобразуется в комплементарная ДНК (кДНК) с использованием обратная транскриптаза. Затем кДНК используют в качестве матрицы для экспоненциальной амплификации с помощью ПЦР. QT-НАСБА в настоящее время является наиболее чувствительным доступным методом обнаружения РНК.[16][неуместное цитирование ] Использование ОТ-ПЦР для обнаружения транскрипта РНК произвело революцию в изучении экспрессии генов в следующих важных направлениях:

  • Сделано теоретически возможным обнаружение транскриптов практически любого гена.[17]
  • Обеспечивает амплификацию образцов и устраняет необходимость в большом количестве исходного материала, необходимого при использовании нозерн-блоттинга.[18][19]
  • Обеспечивается устойчивость к деградации РНК, пока РНК, охватывающая праймер, не повреждена[18]

Одноэтапная ОТ-ПЦР против двухэтапной ОТ-ПЦР

Одноэтапная или двухэтапная ОТ-ПЦР

Количественная оценка мРНК с помощью ОТ-ПЦР может быть проведена либо одностадийная, либо двухступенчатая реакция. Разница между двумя подходами заключается в количестве трубок, используемых при выполнении процедуры. Двухступенчатая реакция требует, чтобы реакция обратной транскриптазы и амплификация ПЦР проводились в отдельных пробирках. Недостатком двухэтапного подхода является подверженность загрязнению из-за более частого обращения с пробами.[20] С другой стороны, вся реакция от синтеза кДНК до ПЦР-амплификации происходит в одной пробирке при одностадийном подходе. Считается, что одноэтапный подход сводит к минимуму экспериментальные вариации, объединяя все ферментативные реакции в одной среде. Это исключает этапы пипетирования продукта кДНК, которые являются трудоемкими и склонными к загрязнению, для реакции ПЦР. Дальнейшее использование толерантных к ингибиторам полимераз, усилителей полимеразы с оптимизированными условиями одностадийной ОТ-ПЦР, поддерживает обратную транскрипцию РНК из неочищенных или сырых образцов, таких как цельная кровь и сыворотка.[21][22] Однако исходные матрицы РНК склонны к деградации при одноэтапном подходе, и использование этого подхода не рекомендуется, когда требуются повторные анализы одного и того же образца. Кроме того, одноэтапный подход менее точен по сравнению с двухэтапным. Это также предпочтительный метод анализа при использовании ДНК-связывающих красителей, таких как SYBR Зеленый с момента устранения праймеры-димеры может быть достигнуто путем простого изменения температура плавления. Тем не менее, одноэтапный подход является относительно удобным решением для быстрого обнаружения целевой РНК непосредственно при биосенсинге.[нужна цитата ]

Конечная ОТ-ПЦР против ОТ-ПЦР в реальном времени

Количественное определение продуктов ОТ-ПЦР в основном можно разделить на две категории: конечная точка и в реальном времени.[16] Использование конечной точки ОТ-ПЦР является предпочтительным для измерения изменений экспрессии генов в небольшом количестве образцов, но ОТ-ПЦР в реальном времени стала золотым стандартом для проверки результатов, полученных в результате анализа массива или изменений экспрессии генов на глобальном уровне. шкала.[23]

Конечная ОТ-ПЦР

Подходы к измерению конечной точки ОТ-ПЦР требуют определения уровней экспрессии генов с помощью флуоресцентных красителей, таких как этидиум бромид,[24][25] P32 маркировка продуктов ПЦР с использованием фосфорный сканер,[26] или по сцинтилляционный счет.[19] Конечная точка ОТ-ПЦР обычно достигается с использованием трех различных методов: относительного, конкурентного и сравнительного.[27][28]

Относительная ОТ-ПЦР
Относительная количественная оценка RT-PCR включает коамплификацию внутреннего контроля одновременно с интересующим геном. Внутренний контроль используется для нормализации образцов. После нормализации можно провести прямое сравнение относительных количеств транскриптов в нескольких образцах мРНК. Следует отметить одну меру предосторожности: внутренний контроль должен выбираться таким образом, чтобы экспериментальное лечение не влияло на него. Уровень экспрессии должен быть постоянным для всех образцов и с учетом интересующей мРНК, чтобы результаты были точными и значимыми. Поскольку количественная оценка результатов анализируется путем сравнения линейного диапазона целевой и контрольной амплификации, крайне важно принять во внимание исходную концентрацию целевых молекул и скорость их амплификации до начала анализа. Результаты анализа выражаются в виде отношения сигнала гена к сигналу внутреннего контроля, значения которого затем можно использовать для сравнения между образцами при оценке относительной экспрессии целевой РНК.[25][28][29]
Конкурентная ОТ-ПЦР
Для абсолютной количественной оценки используется метод конкурентной ОТ-ПЦР. Он включает использование синтетической «конкурентной» РНК, которую можно отличить от целевой РНК по небольшой разнице в размере или последовательности. Для создания синтетической РНК важно быть идентичной по последовательности, но немного короче целевой РНК для получения точных результатов. После создания и синтеза известное количество конкурирующей РНК добавляется к экспериментальным образцам и коамплифицируется с мишенью с помощью ОТ-ПЦР. Затем строят кривую концентрации конкурентной РНК, и ее используют для сравнения сигналов ОТ-ПЦР, полученных от эндогенных транскриптов, для определения количества мишени, присутствующей в образце.[28][30]
Сравнительная ОТ-ПЦР
Сравнительная ОТ-ПЦР похожа на конкурентную ОТ-ПЦР в том, что целевая РНК конкурирует за реагенты для амплификации в рамках одной реакции с внутренним стандартом неродственной последовательности. После завершения реакции результаты сравниваются с кривой внешнего стандарта для определения целевой концентрации РНК. По сравнению с методами относительной и конкурентной количественной оценки сравнительная ОТ-ПЦР считается более удобным методом для использования, поскольку не требует от исследователя проведения пилотного эксперимента; в относительной ОТ-ПЦР должен быть заранее определен диапазон экспоненциальной амплификации мРНК, а при конкурентной ОТ-ПЦР должна быть синтезирована синтетическая конкурирующая РНК.[28][31][32][33][34]

ОТ-ПЦР в реальном времени

Появление в последние несколько лет новых методов флуоресцентной маркировки ДНК сделало возможным анализ и обнаружение продуктов ПЦР в реальном времени и, как следствие, привело к широкому распространению ОТ-ПЦР в реальном времени для анализа экспрессии генов. В настоящее время ОТ-ПЦР в реальном времени является не только предпочтительным методом количественной оценки экспрессии генов, но и предпочтительным методом получения результатов анализ массива и экспрессия генов в глобальном масштабе. В настоящее время доступны четыре различных флуоресцентных ДНК-зонда для обнаружения продуктов ПЦР с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени: SYBR Зеленый, TaqMan, молекулярные маяки, и зонды скорпиона. Все эти зонды позволяют обнаруживать продукты ПЦР, генерируя флуоресцентный сигнал. В то время как краситель SYBR Green излучает свой флуоресцентный сигнал, просто связываясь с двухцепочечной ДНК в растворе, генерация флуоресценции зондов TaqMan, молекулярных маяков и скорпионов зависит от Фёрстеровский резонансный перенос энергии (FRET) связывание молекулы красителя и гасителя с олигонуклеотидными субстратами.[35]

SYBR Зеленый
Когда SYBR Green связывается с двухцепочечной ДНК продуктов ПЦР, он будет излучать свет при возбуждении. Интенсивность флуоресценции увеличивается по мере накопления продуктов ПЦР. Этот метод прост в использовании, поскольку нет необходимости в создании зондов из-за отсутствия специфичности их связывания. Однако, поскольку краситель не отличает двухцепочечную ДНК от продуктов ПЦР и от димеров праймеров, переоценка целевой концентрации является обычной проблемой. Если точная количественная оценка является абсолютной необходимостью, необходимо провести дальнейший анализ для подтверждения результатов. Тем не менее, среди методов обнаружения продуктов ОТ-ПЦР в реальном времени SYBR Green является наиболее экономичным и простым в использовании.[16][23]
Зонды Taqman
TaqMan зонды
Зонды TaqMan представляют собой олигонуклеотиды, которые имеют флуоресцентный зонд, прикрепленный к 5'-концу и гаситель к 3'-концу. Во время ПЦР-амплификации эти зонды будут гибридизоваться с целевыми последовательностями, расположенными в ампликон и поскольку полимераза реплицирует матрицу со связанным TaqMan, она также расщепляет флуоресцентный зонд из-за активности полимеразы 5'-нуклеазы. Поскольку непосредственная близость между молекулой гашения и флуоресцентным зондом обычно предотвращает обнаружение флуоресценции через FRET, развязка приводит к увеличению интенсивности флуоресценции, пропорциональному количеству циклов расщепления зонда. Хотя хорошо спроектированные зонды TaqMan дают точные результаты ОТ-ПЦР в реальном времени, синтез требует больших затрат времени и средств, когда для каждой анализируемой мишени мРНК необходимо делать отдельные зонды.[16][17][36]
Молекулярные зонды-маяки
Подобно зондам TaqMan, молекулярные маяки также используют обнаружение FRET с флуоресцентными зондами, прикрепленными к 5'-концу, и гасителем, прикрепленным к 3'-концу олигонуклеотидного субстрата. Однако, в то время как флуоресцентные зонды TaqMan расщепляются во время амплификации, зонды молекулярных маяков остаются неповрежденными и повторно связываются с новой мишенью во время каждого цикла реакции. В свободном состоянии в растворе непосредственная близость флуоресцентного зонда и молекулы гасителя предотвращает флуоресценцию через FRET. Однако, когда зонды молекулярных радиомаяков гибридизуются с мишенью, флуоресцентный краситель и гаситель разделяются, что приводит к излучению света при возбуждении. Как и в случае с зондами TaqMan, синтезировать молекулярные маяки дорого, и для каждой РНК-мишени требуются отдельные зонды.[20]
Зонды Scorpion
Зонды-скорпионы, как и молекулярные маяки, не будут флуоресцентно активными в негибридизированном состоянии, опять же из-за того, что флуоресцентный зонд на 5'-конце гасится фрагментом на 3'-конце олигонуклеотида. Однако у Scorpions 3'-конец также содержит последовательность, комплементарную продукту удлинения праймера на 5'-конце. Когда расширение Scorpion связывается со своим комплементом на ампликоне, структура Scorpion открывается, предотвращает FRET и позволяет измерять флуоресцентный сигнал.[37]
Мультиплексные зонды
Зонды TaqMan, молекулярные маяки и скорпионы позволяют одновременно измерять продукты ПЦР в одной пробирке. Это возможно, потому что каждый из различных флуоресцентных красителей может быть связан с определенным спектром излучения. Использование мультиплексных зондов не только экономит время и усилия без ущерба для полезности теста, но и их применение в широких областях исследований, таких как анализ делеции генов, анализ мутаций и полиморфизма, количественный анализ и обнаружение РНК, делает его бесценным методом для лабораторий много дисциплины.[37][38][39]

Для количественной оценки результатов, полученных с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени, обычно используются две стратегии; метод стандартной кривой и метод сравнительного порога.[40]

Заявление

Экспоненциальная амплификация посредством полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией обеспечивает высокочувствительный метод, с помощью которого можно обнаружить очень низкое количество копий молекул РНК. ОТ-ПЦР широко используется в диагностике генетических заболеваний и, полуколичественно, при определении содержания различных конкретных молекул РНК в клетке или ткани в качестве меры экспрессия гена.

Методы исследования

ОТ-ПЦР обычно используется в исследовательских методах для измерения экспрессии генов. Например, Lin et al. использовали qRT-PCR для измерения экспрессии генов Gal в дрожжевых клетках. Во-первых, Lin et al. сконструировали мутацию белка, предположительно участвующего в регуляции генов Gal. Было высказано предположение, что эта мутация избирательно подавляет экспрессию Gal. Чтобы подтвердить это, уровни экспрессии генов дрожжевых клеток, содержащих эту мутацию, анализировали с помощью qRT-PCR. Исследователи смогли окончательно определить, что мутация этого регуляторного белка снижает экспрессию Gal.[41] Нозерн-блот Анализ используется для дальнейшего изучения экспрессии генов РНК.

Вставка гена

ОТ-ПЦР также может быть очень полезной при вставке эукариотический гены в прокариоты. Поскольку большинство эукариотических генов содержат интроны, которые присутствуют в геноме, но не в зрелой мРНК, кДНК, полученная в результате реакции ОТ-ПЦР, является точной (без учета подверженной ошибкам природы обратных транскриптаз) последовательностью ДНК, которая будет непосредственно транслироваться в белок после транскрипция. Когда эти гены экспрессируются в прокариотических клетках ради продукции или очистки белка, РНК, полученная непосредственно в результате транскрипции, не нуждается в сплайсинге, поскольку транскрипт содержит только экзоны. (Прокариоты, такие как E. coli, лишены механизма сплайсинга мРНК эукариот).

Диагностика генетических заболеваний

ОТ-ПЦР может использоваться для диагностики генетическое заболевание Такие как Синдром Леша – Найхана. Это генетическое заболевание вызвано неисправностью в HPRT1 ген, который клинически приводит к летальному исходу мочевой камень мочевой кислоты и симптомы, похожие на подагра.[6][требуется разъяснение ] Анализируя беременную мать и плод уровни экспрессии мРНК HPRT1 покажут, является ли мать носителем и будет ли у плода вероятно развитие синдрома Леша-Найхана.[42]

Обнаружение рака

Ученые работают над способами использования ОТ-ПЦР в рак обнаружение, чтобы помочь улучшить прогноз, и контролировать реакцию на терапию. Циркулирующий опухолевые клетки производят уникальные транскрипты мРНК в зависимости от типа рака. Цель состоит в том, чтобы определить, какие транскрипты мРНК являются лучшими. биомаркеры для конкретного типа раковых клеток, а затем проанализируйте уровни их экспрессии с помощью ОТ-ПЦР.[43]

ОТ-ПЦР обычно используется при изучении геномов вирусы чьи геномы состоят из РНК, например Грипп А, ретровирусы подобно ВИЧ и SARS-CoV-2 [44].

Вызовы

Несмотря на свои основные преимущества, ОТ-ПЦР не лишена недостатков. Экспоненциальный рост обратного транскрибирования комплементарная ДНК (кДНК) во время нескольких циклов ПЦР приводит к неточному количественному определению конечной точки из-за сложности поддержания линейности.[45] Чтобы обеспечить точное обнаружение и количественную оценку содержания РНК в образце, была разработана qRT-PCR с использованием модификации на основе флуоресценции для мониторинга продуктов амплификации во время каждого цикла PCR. Чрезвычайная чувствительность этого метода может быть обоюдоострым мечом, поскольку даже малейшее загрязнение ДНК может привести к нежелательным результатам.[46] Простой метод устранения ложноположительных результатов - это включение якорей или теги к 5'-области специфичного для гена праймера.[47] Кроме того, планирование и разработка количественных исследований могут быть технически сложными из-за существования многочисленных источников вариаций, включая концентрацию матрицы и эффективность амплификации.[31]

Протокол

ОТ-ПЦР может быть проведена с использованием протокола одноэтапной ОТ-ПЦР или двухэтапного протокола ОТ-ПЦР.

Одноэтапная ОТ-ПЦР

В одну стадию ОТ-ПЦР берут мишени мРНК (до 6 т.п.н.) и подвергают их обратной транскрипции, а затем амплификации ПЦР в одной пробирке. Для достижения наилучших результатов используйте только неповрежденную РНК высокого качества. Обязательно используйте праймер, специфичный для последовательности.

  1. Выберите набор для одноэтапной ОТ-ПЦР, который должен включать смесь с обратной транскриптазой и системой ПЦР, такой как ДНК-полимераза Taq и полимераза для проверки.
  2. Приобретите все необходимые материалы, оборудование и инструменты (в комплекты должен быть включен подробный список необходимых предметов).
  3. Подготовьте реакционную смесь, которая будет включать dNTP, праймеры, матричную РНК, необходимые ферменты и буферный раствор.
  4. Добавьте смесь в пробирку для ПЦР для каждой реакции. Затем добавьте шаблонную РНК.
  5. Поместите пробирки для ПЦР в термоциклер, чтобы начать цикл. Первый цикл - это обратная транскрипция для синтеза кДНК. Второй цикл - начальная денатурация. Во время этого цикла инактивируется обратная транскриптаза. Следующие 40-50 циклов представляют собой программу амплификации, которая состоит из трех этапов: (1) денатурация, (2) отжиг, (3) удлинение.
  6. Затем продукты ОТ-ПЦР можно анализировать с помощью гель-электрофорез.[48][49]

(Руководство по применению ПЦР и биологические инструменты)

Двухэтапная ОТ-ПЦР

Двухэтапная ОТ-ПЦР, как следует из названия, происходит в два этапа. Сначала обратная транскрипция, а затем ПЦР. Этот метод более чувствителен, чем одноэтапный. Наборы также полезны для двухэтапной ОТ-ПЦР. Как и в случае одноэтапной процедуры, для достижения наилучших результатов используйте только неповрежденную РНК высокого качества. Праймер для двухэтапной обработки не обязательно должен быть специфичным для последовательности.

Первый шаг

  1. Объедините матричную РНК, праймер, смесь dNTP и воду, свободную от нуклеаз, в пробирке для ПЦР.
  2. Добавьте ингибитор РНКазы и обратную транскриптазу в пробирку для ПЦР.
  3. Поместите пробирку для ПЦР в термоциклер на один цикл, который включает отжиг, расширение, а затем инактивацию обратной транскриптазы.
  4. Переходите непосредственно к ПЦР или храните на льду, пока не будет проведена ПЦР.

Шаг второй

  1. Добавить мастер-микс (содержащий буфер, смесь dNTP, MgCl2, Taq-полимеразу и воду, свободную от нуклеаз) в каждую пробирку для ПЦР.
  2. Добавьте соответствующий грунт.
  3. Поместите пробирки для ПЦР в термоциклер на 30 циклов программы амплификации, которая включает три этапа: (1) денатурация (2) отжиг (3) элонгация.
  4. Затем продукты RT-PCR можно анализировать с помощью гель-электрофореза.[50]

Правила публикации

Количественный анализ ОТ-ПЦР считается золотым стандартом для измерения количества копий конкретных мишеней кДНК в образце, но он плохо стандартизован.[51] В результате, несмотря на то, что существует множество публикаций, использующих эту технику, многие из них содержат неадекватные экспериментальные детали и используют неподходящий анализ данных, чтобы сделать неправильные выводы. Из-за присущей вариабельности качества любых количественных данных ПЦР не только рецензентам трудно оценивать эти рукописи, но и исследования становятся невозможными для воспроизведения.[52] Признавая необходимость стандартизации отчетов об условиях экспериментов, Минимум информации для публикации количественных экспериментов ПЦР в реальном времени (MIQE, произносится как mykee) рекомендации были опубликованы международным консорциумом академических ученых. Рекомендации MIQE описывают минимум информации, необходимой для оценки количественная ПЦР эксперименты, которые должны потребоваться для публикации для поощрения лучшей экспериментальной практики и обеспечения актуальности, точности, правильной интерпретации и повторяемости количественных данных ПЦР.[53]

Помимо руководящих указаний по отчетности, MIQE подчеркивает необходимость стандартизации номенклатуры, связанной с количественной ПЦР, чтобы избежать путаницы; Например, сокращение qPCR следует использовать для количественная ПЦР в реальном времени и RT-qPCR следует использовать для обратной транскрипции-qPCR, а гены, используемые для нормализации, следует называть эталонными генами, а не гены домашнего хозяйства. Он также предлагает не использовать коммерческие термины, такие как зонды TaqMan, а вместо этого использовать их как датчики гидролиза. Кроме того, предлагается использовать цикл количественной оценки (Cq) для описания цикла ПЦР, используемого для количественной оценки, вместо порогового цикла (Ct), точки пересечения (Cp) и точки взлета (TOP), которые относятся к одному и тому же значению, но были придуманы разными производителями инструменты реального времени.[51]

Руководство состоит из следующих элементов: 1) план эксперимента, 2) образец, 3) экстракция нуклеиновой кислоты, 4) обратная транскрипция, 5) информация о мишени кПЦР, 6) олигонуклеотиды, 7) протокол, 8) проверка и 9) данные. анализ. Конкретные элементы в каждом элементе имеют метку E (обязательно) или D (желательно). Те, которые помечены E, считаются критическими и незаменимыми, в то время как помеченные D считаются второстепенными, но важными для передовой практики.[53]

Рекомендации

  1. ^ Фриман В.М., Уокер С.Дж., Врана К.Е. (Январь 1999 г.). «Количественная ОТ-ПЦР: подводные камни и потенциал». Биотехнологии. 26 (1): 112–22, 124–5. Дои:10.2144 / 99261rv01. PMID  9894600.
  2. ^ Маккей, Ян (2007). ПЦР в реальном времени в микробиологии: от диагностики до характеристики. Норфолк, Англия: Caister Academic Press. стр.440. ISBN  978-1-904455-18-9.
  3. ^ Джойс С. (2002). Количественная ОТ-ПЦР. Обзор текущих методологий. Методы Мол. Биол. 193. С. 83–92. Дои:10.1385 / 1-59259-283-X: 083. ISBN  978-1-59259-283-8. PMID  12325527.
  4. ^ Кан ХП, Цзян Т., Ли YQ и др. (2010). «Дуплексный анализ ОТ-ПЦР в реальном времени для обнаружения вируса птичьего гриппа H5N1 и вируса пандемического гриппа H1N1». Virol. J. 7: 113. Дои:10.1186 / 1743-422X-7-113. ЧВК  2892456. PMID  20515509.
  5. ^ а б Бустин С.А., Бенес В., Нолан Т., Пфаффл М.В. (июнь 2005 г.). «Количественная RT-PCR в реальном времени - перспектива». J. Mol. Эндокринол. 34 (3): 597–601. CiteSeerX  10.1.1.528.6638. Дои:10.1677 / jme.1.01755. PMID  15956331.
  6. ^ Варконьи-Гасич Э., Хелленс Р.П. (2010). «qRT-PCR малых РНК». Эпигенетика растений. Методы молекулярной биологии. 631. С. 109–22. Дои:10.1007/978-1-60761-646-7_10. ISBN  978-1-60761-645-0. PMID  20204872.
  7. ^ Тейлор С., Вакем М., Дейкман Г., Альсаррадж М., Нгуен М. (апрель 2010 г.). «Практический подход к RT-qPCR-Publishing данных, соответствующих рекомендациям MIQE». Методы. 50 (4): S1–5. Дои:10.1016 / j.ymeth.2010.01.005. PMID  20215014.
  8. ^ Спакман Э., Сенне Д.А., Майерс Т.Дж. и др. (Сентябрь 2002 г.). «Разработка метода ПЦР с обратной транскриптазой в реальном времени для вируса гриппа типа А и подтипов птичьего гемагглютинина H5 и H7». J. Clin. Микробиол. 40 (9): 3256–60. Дои:10.1128 / см.40.9.3256-3260.2002. ЧВК  130722. PMID  12202562.
  9. ^ «УСКОРЕННОЕ РАЗРЕШЕНИЕ НА ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В ЧРЕЗВЫЧАЙНЫХ СИТУАЦИЯХ (EUA) РЕЗЮМЕ ОТ-ПЦР-ТЕСТА COVID-19 (ЛАБОРАТОРНАЯ КОРПОРАЦИЯ АМЕРИКИ). FDA. Получено 3 апреля 2020.
  10. ^ Элвин Дж. С., Кемп Диджей, Старк Г. Р. (декабрь 1977 г.). «Метод обнаружения специфических РНК в агарозных гелях путем переноса на диазобензилоксиметилбумагу и гибридизации с ДНК-зондами». Proc. Natl. Акад. Sci. СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ. 74 (12): 5350–4. Bibcode:1977PNAS ... 74.5350A. Дои:10.1073 / пнас.74.12.5350. ЧВК  431715. PMID  414220.
  11. ^ Streit S, Michalski CW, Erkan M, Kleeff J, Friess H (2009). «Нозерн-блоттинг для обнаружения и количественного определения РНК в клетках и тканях рака поджелудочной железы». Нат Проток. 4 (1): 37–43. Дои:10.1038 / nprot.2008.216. PMID  19131955.
  12. ^ Бустин С.А. (октябрь 2000 г.). «Абсолютное количественное определение мРНК с использованием анализов полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в реальном времени». J. Mol. Эндокринол. 25 (2): 169–93. Дои:10.1677 / jme.0.0250169. PMID  11013345.
  13. ^ Йерро Н., Эстеве-Зарзосо Б., Гонсалес А., Мас А., Гийамон Дж. М. (ноябрь 2006 г.). «Количественная ПЦР в реальном времени (QPCR) и обратная транскрипция-QPCR для обнаружения и подсчета общего количества дрожжей в вине». Appl. Environ. Микробиол. 72 (11): 7148–55. Дои:10.1128 / AEM.00388-06. ЧВК  1636171. PMID  17088381.
  14. ^ Сломка М.Дж., Павлидис Т., Кауард В.Дж. и др. (Июль 2009 г.). «Валидированные методы ПЦР с обратной транскриптазой в реальном времени для диагностики и патотипирования евразийских вирусов птичьего гриппа H7». Другие респираторные вирусы гриппа. 3 (4): 151–64. Дои:10.1111 / j.1750-2659.2009.00083.x. ЧВК  4634683. PMID  19627372.
  15. ^ Краткое описание миссии: Полевой визит ВОЗ в Ухань, Китай, 20-21 января 2020 г .: https://www.who.int/china/news/detail/22-01-2020-field-visit-wuhan-china-jan-2020
  16. ^ а б c d Шмитген Т.Д., Закрайсек Б.А., Миллс А.Г., Горн В., Певец М.Дж., Рид М.В. (октябрь 2000 г.). «Количественная полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией для изучения распада мРНК: сравнение конечной точки и методов в реальном времени». Анальный. Биохим. 285 (2): 194–204. Дои:10.1006 / abio.2000.4753. PMID  11017702. S2CID  258810.
  17. ^ а б Дипак С., Коттапалли К., Раквал Р. и др. (Июнь 2007 г.). «ПЦР в реальном времени: революционные методы обнаружения и анализа экспрессии генов». Curr. Геномика. 8 (4): 234–51. Дои:10.2174/138920207781386960. ЧВК  2430684. PMID  18645596.
  18. ^ а б Бустин С.А. (август 2002 г.). «Количественная оценка мРНК с использованием ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени (ОТ-ПЦР): тенденции и проблемы». J. Mol. Эндокринол. 29 (1): 23–39. Дои:10.1677 / jme.0.0290023. PMID  12200227.
  19. ^ а б Souazé F, Ntodou-Thomé A, Tran CY, Rostène W, Forgez P (август 1996). «Количественная ОТ-ПЦР: пределы и точность». Биотехнологии. 21 (2): 280–5. Дои:10.2144 / 96212rr01. PMID  8862813.
  20. ^ а б Вонг М.Л., Медрано Дж. Ф. (июль 2005 г.). «ПЦР в реальном времени для количественного определения мРНК». Биотехнологии. 39 (1): 75–85. Дои:10.2144 / 05391rv01. PMID  16060372.
  21. ^ Ли, Ланг; Он, Цзянь-ань; Ван, Вэй; Ся, Юнь; Песня, Ли; Чен, Цзэ-хан; Цзо, Ханг-чжи; Тан, Сюань-Пин; Хо, Аарон Хо-Пуи; Конг, Сиу-Кай; Лу, Джеки Фонг-Чуэн (01.08.2019). «Разработка метода количественной ПЦР с прямой обратной транскрипцией (dirRT-qPCR) для клинической диагностики вируса Зика». Международный журнал инфекционных болезней. 85: 167–174. Дои:10.1016 / j.ijid.2019.06.007. ISSN  1201-9712. PMID  31202908.
  22. ^ Бахофен, Клаудиа; Уиллоби, Ким; Задокс, Рут; Берр, Пол; Меллор, Доминик; Рассел, Джордж К. (2013-06-01). «Прямая ОТ-ПЦР из сыворотки позволяет быстро и экономично провести филогенетический анализ вируса вирусной диареи крупного рогатого скота». Журнал вирусологических методов. 190 (1): 1–3. Дои:10.1016 / j.jviromet.2013.03.015. ISSN  0166-0934. PMID  23541784.
  23. ^ а б Радживан М.С., Вернон С.Д., Тайсаванг Н., Унгер ER (февраль 2001 г.). «Подтверждение профилей экспрессии генов на основе массивов с помощью (кинетической) ОТ-ПЦР в реальном времени». Дж Мол Диаг. 3 (1): 26–31. Дои:10.1016 / S1525-1578 (10) 60646-0. ЧВК  1907344. PMID  11227069.
  24. ^ Stone-Marschat M, Carville A, Skowronek A, Laegreid WW (март 1994). «Обнаружение вируса африканской чумы лошадей методом ПЦР с обратной транскрипцией». J. Clin. Микробиол. 32 (3): 697–700. Дои:10.1128 / JCM.32.3.697-700.1994. ЧВК  263109. PMID  8195381.
  25. ^ а б Минтон А.П. (апрель 1995 г.). «Конфайнмент как детерминант макромолекулярной структуры и реакционной способности. II. Эффекты слабо притягивающих взаимодействий между ограниченными макросолидами и ограничивающими структурами». Биофиз. J. 68 (4): 1311–22. Bibcode:1995BpJ .... 68,1311M. Дои:10.1016 / S0006-3495 (95) 80304-8. ЧВК  1282026. PMID  7787020.
  26. ^ Сюй М., Ю. Э., Спрушанский О., Макихерн М. Дж., Лю Н. Ф. (июль 2012 г.). «Функциональный анализ единственного гомолога Est1 / Ebs1 в Kluyveromyces lactis выявляет роли как в поддержании теломер, так и в устойчивости к рапамицину». Эукариотическая клетка. 11 (7): 932–42. Дои:10.1128 / EC.05319-11. ЧВК  3416500. PMID  22544908.
  27. ^ Шмитген Т.Д., Ливак К.Дж. (2008). «Анализ данных ПЦР в реальном времени сравнительным методом C (T)». Нат Проток. 3 (6): 1101–8. Дои:10.1038 / nprot.2008.73. PMID  18546601.
  28. ^ а б c d Тан И-Вэй (13.09.2012), Передовые методы диагностической микробиологии, ISBN  978-1461439691
  29. ^ Гаузе В.К., Адамович Дж. (Июнь 1994 г.). «Использование ПЦР для количественной оценки экспрессии генов». Методы ПЦР Приложение. 3 (6): S123–35. Дои:10.1101 / gr.3.6.s123. PMID  7522722.
  30. ^ Цай SJ, Wiltbank MC (ноябрь 1996 г.). «Количественная оценка мРНК с использованием конкурентной ОТ-ПЦР с методологией стандартной кривой». Биотехнологии. 21 (5): 862–6. Дои:10.2144 / 96215st04. PMID  8922627.
  31. ^ а б Рамакерс К., Руйтер Дж. М., Депрез Р. Х., Мурман А. Ф. (март 2003 г.). «Не требующий допущений анализ количественных данных полимеразной цепной реакции в реальном времени». Neurosci. Латыш. 339 (1): 62–6. Дои:10.1016 / S0304-3940 (02) 01423-4. PMID  12618301.
  32. ^ Halford WP, ​​Falco VC, Gebhardt BM, Carr DJ (январь 1999 г.). «Собственная количественная способность обратной транскрипционной полимеразной цепной реакции». Анальный. Биохим. 266 (2): 181–91. Дои:10.1006 / abio.1998.2913. PMID  9888974.
  33. ^ Король N (2010). «Использование сравнительной количественной ОТ-ПЦР для исследования влияния инкубации цистеина на экспрессию GPx1 в свежевыделенных кардиомиоцитах». Протоколы ОТ-ПЦР. Методы молекулярной биологии. 630. С. 215–32. Дои:10.1007/978-1-60761-629-0_14. ISBN  978-1-60761-628-3. PMID  20301000.
  34. ^ Чанг Дж. Т., Чен И. Х., Ляо К. Т. и др. (Ноябрь 2002 г.). «Сравнительный метод ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени для количественного определения ангиогенных факторов роста у пациентов с раком головы и шеи». Clin. Биохим. 35 (8): 591–6. Дои:10.1016 / S0009-9120 (02) 00403-4. PMID  12498992.
  35. ^ Холден, М. Дж .; Ван, Л. (2008). «Количественная ПЦР в реальном времени: варианты и проблемы с флуоресцентным датчиком». Стандартизация и обеспечение качества измерений флуоресценции II. Серия Спрингера по флуоресценции. 6. п. 489. Дои:10.1007/4243_2008_046. ISBN  978-3-540-70570-3.
  36. ^ Ян Д.К., Квеон С.Х., Ким Б.Х. и др. (Декабрь 2004 г.). «Цепная реакция полимеразы обратной транскрипции TaqMan для обнаружения вируса японского энцефалита». J. Vet. Наука. 5 (4): 345–51. Дои:10.4142 / jvs.2004.5.4.345. PMID  15613819.
  37. ^ а б Шарки Ф. Х., Банат И. М., Марчант Р. (июль 2004 г.). «Обнаружение и количественная оценка экспрессии генов в экологической бактериологии». Appl. Environ. Микробиол. 70 (7): 3795–806. Дои:10.1128 / AEM.70.7.3795-3806.2004. ЧВК  444812. PMID  15240248.
  38. ^ Рэтклифф Р.М., Чанг Дж., Кок Т., Слоотс Т.П. (июль 2007 г.). «Молекулярная диагностика медицинских вирусов». Curr Issues Mol Biol. 9 (2): 87–102. PMID  17489437.
  39. ^ Эльнифро Е.М., Ашши А.М., Купер Р.Дж., Клаппер П.Е. (октябрь 2000 г.). «Мультиплексная ПЦР: оптимизация и применение в диагностической вирусологии». Clin. Microbiol. Rev. 13 (4): 559–70. Дои:10.1128 / см 13.4.559-570.2000. ЧВК  88949. PMID  11023957.
  40. ^ Бустин С.А. (июль 2005 г.). «Количественная ПЦР на основе флуоресценции в реальном времени: обзор текущих процедур и предпочтений». Эксперт Преподобный Мол. Диаг. 5 (4): 493–8. Дои:10.1586/14737159.5.4.493. PMID  16013967. S2CID  1833811.
  41. ^ Линь Л., Чемберлен Л., Чжу Л. Дж., Грин М.Р. (февраль 2012 г.). «Анализ Gal4-направленной активации транскрипции с использованием мутантов Tra1, селективно дефектных по взаимодействию с Gal4». Proc. Natl. Акад. Sci. СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ. 109 (6): 1997–2002. Bibcode:2012ПНАС..109.1997Л. Дои:10.1073 / pnas.1116340109. ЧВК  3277556. PMID  22308403.
  42. ^ Торрес Р.Дж., Гарсия М.Г., Пуч Дж.Г. (декабрь 2012 г.). «Носитель и пренатальная диагностика болезни Леша-Найхана из-за дефекта регуляции экспрессии гена HPRT». Ген. 511 (2): 306–7. Дои:10.1016 / j.gene.2012.09.121. PMID  23046577.
  43. ^ Си Л., Никастри Д.Г., Эль-Хефнави Т., Хьюз С.Дж., Лукетич Д.Д., Годфри Т.Е. (июль 2007 г.). «Оптимальные маркеры для количественной ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени для обнаружения циркулирующих опухолевых клеток от меланомы, рака груди, толстой кишки, пищевода, головы и шеи, а также рака легких». Clin. Chem. 53 (7): 1206–15. Дои:10.1373 / Clinchem.2006.081828. PMID  17525108.
  44. ^ «Коронавирус: тест il viaggio dei». Istituto Superiore di Sanità.
  45. ^ Шиао YH (декабрь 2003 г.). «Новый метод полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией для точной количественной оценки». BMC Biotechnol. 3: 22. Дои:10.1186/1472-6750-3-22. ЧВК  317330. PMID  14664723.
  46. ^ Геттеми Дж. М., Ма Б., Алик М., Gold MH (февраль 1998 г.). "ПЦР-анализ обратной транскрипции регуляции семейства генов пероксидазы марганца". Appl. Environ. Микробиол. 64 (2): 569–74. Дои:10.1128 / AEM.64.2.569-574.1998. ЧВК  106084. PMID  9464395.
  47. ^ Мартель, Фатима; Дирк Грюндеманн; Эдгар Шёйг (31 марта 2002 г.). «Простой метод исключения ложноположительных результатов при ОТ-ПЦР». J Biochem Mol Biol. 35 (2): 248–250. Дои:10.5483 / BMBRep.2002.35.2.248. PMID  12297038.
  48. ^ «OneStep Kit с инструментами с высоким разрешением». Биоинструменты. Архивировано из оригинал 20 мая 2013 г.. Получено 12 декабря 2012.
  49. ^ Деген, Ханс-Иоахим; Деуфель, Аннетт; Эйзель, Дорис; Грюневальд-Янхо, Стефани; Кизи, Джо (2006). Руководство по применению ПЦР (PDF) (3-е изд.). Рош Диагностика. С. 135–137.
  50. ^ «Двухэтапный протокол ОТ-ПЦР» (PDF). Массачусетский технологический институт. Получено 12 декабря 2012.
  51. ^ а б "www.microarrays.ca" (PDF).
  52. ^ Бустин С.А. (апрель 2010 г.). «Зачем нужны руководящие принципы публикации qPCR? - Случай для MIQE». Методы. 50 (4): 217–26. Дои:10.1016 / j.ymeth.2009.12.006. PMID  20025972.
  53. ^ а б Бустин С.А., Бенеш В., Гарсон Дж. А. и др. (Апрель 2009 г.). «Рекомендации MIQE: минимум информации для публикации количественных экспериментов ПЦР в реальном времени». Clin. Chem. 55 (4): 611–22. Дои:10.1373 / Clinchem.2008.112797. PMID  19246619.

внешняя ссылка