TaqMan - TaqMan

TaqMan зонды гидролиз зонды которые предназначены для повышения специфичности количественная ПЦР. Впервые об этом методе сообщил в 1991 г. исследователь. Кэри Маллис в Cetus Corporation,[1] и технология была впоследствии разработана Hoffmann-La Roche для диагностических тестов и Прикладные биосистемы (теперь часть Thermo Fisher Scientific ) для исследовательских приложений.

Принцип датчика TaqMan основан на 5´ – 3´ экзонуклеаза деятельность Taq полимераза отщеплять зонд с двойной меткой во время гибридизации с комплементарной целевой последовательностью и флуорофор обнаружение на основе.[2] Как и в других количественная ПЦР методов, результирующий сигнал флуоресценции позволяет количественно измерить накопление продукта во время экспоненциальный этапы ПЦР; однако зонд TaqMan значительно увеличивает специфичность обнаружения. Зонды TaqMan были названы в честь видеоигры Pac-Man (Taq Полимераза + PacMan = TaqMan), поскольку его механизм основан на принципе Pac-Man.[3]

Принцип

Химический механизм зонда TaqMan

Зонды TaqMan состоят из флуорофора ковалентно прикреплен к 5’-концу олигонуклеотид зонд и гаситель на 3’-конце.[4] Несколько разных флуорофоров (например, 6-карбоксифлуоресцеин, акроним: FAM, или тетрахлорфлуоресцеин, аббревиатура: ТЕТ) и тушители (например, тетраметилродамин, аббревиатура: TAMRA).[5] Молекула тушителя тушит флуоресценция испускается флуорофором при возбуждении источником света циклического устройства через Фёрстеровский резонансный перенос энергии (FRET).[6] Пока флуорофор и гаситель находятся рядом, гашение подавляет любые сигналы флуоресценции.

Зонды TaqMan сконструированы так, что они отжигаются в области ДНК, амплифицированной определенным набором праймеров. (В отличие от диаграммы, зонд связывается с одноцепочечной ДНК.) Зонды TaqMan могут быть конъюгированы с фрагментом, связывающим малую бороздку (MGB), дигидроциклопирролоиндолтрипептидом (DPI).3), чтобы увеличить его сродство связывания с целевой последовательностью; Зонды, конъюгированные с MGB, имеют более высокую температуру плавления (Tм) из-за повышенной стабилизации сил Ван-дер-Ваальса. Поскольку Taq полимераза расширяет грунтовка и синтезирует зарождающуюся нить (опять же, на однонитевой матрице, но в направлении, противоположном показанному на диаграмме, то есть от 3 'до 5' комплементарной цепи), от 5 'до 3' экзонуклеаза деятельность Taq полимераза разрушает зонд, отожженный с шаблоном. Разложение зонда высвобождает из него флуорофор и нарушает близость к тушителю, тем самым ослабляя эффект гашения и позволяя флуоресценцию флуорофора. Следовательно, флуоресценция, обнаруженная в количественная ПЦР термоциклер прямо пропорционален высвобожденному флуорофору и количеству ДНК-матрицы, присутствующей в ПЦР.

Приложения

Анализы на основе зондов TaqMan широко используются в количественная ПЦР в исследованиях и медицинские лаборатории:

Смотрите также

Примечания и ссылки

  1. ^ Голландия, П. М .; Abramson, R.D .; Watson, R .; Гельфанд, Д. Х. (1991). «Обнаружение продукта специфической полимеразной цепной реакции с использованием 5 '---- 3' экзонуклеазной активности ДНК-полимеразы Thermus aquaticus». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 88 (16): 7276–7280. Bibcode:1991PNAS ... 88.7276H. Дои:10.1073 / pnas.88.16.7276. ЧВК  52277. PMID  1871133.
  2. ^ Экспрессия гена TaqMan - проекты NCBI
  3. ^ ПЦР TaqMan в реальном времени и приложения в ветеринарии - от PacMan до TaqMan - компьютерная игра снова В архиве 2009-05-05 на Wayback Machine
  4. ^ TaqMan Probes: введение, функционирование и применение
  5. ^ Кутявин И.В., Афонина И.А., Миллс А., Горн В.В., Лухтанов Е.А., Белоусов Е.С., Зингер М.Дж., Валбургер Д.К., Лохов С.Г., Галл А.А., Демпси Р., Рид М.В., Мейер Р.Б., Хеджпет Дж. (2000). «Связывающие ДНК-зонды с 3'-минорной бороздкой повышают специфичность последовательности при температурах удлинения ПЦР». Нуклеиновые кислоты Res. 28 (2): 655–661. Дои:10.1093 / nar / 28.2.655. ЧВК  102528. PMID  10606668.
  6. ^ Бустин С.А. (октябрь 2000 г.). «Абсолютное количественное определение мРНК с использованием анализов полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в реальном времени». J. Mol. Эндокринол. 25 (2): 169–93. Дои:10.1677 / jme.0.0250169. PMID  11013345.
  7. ^ AlleleID - Дизайн анализа для идентификации бактерий

внешняя ссылка

1. Ресурсы TaqMan RT-PCR - базы данных праймеров, программное обеспечение, протоколы[мертвая ссылка ]
2. Конструктор маяков - Программное обеспечение для разработки праймеров и зондов для ПЦР в реальном времени, включая праймеры SYBR Green, зонды TaqMan, молекулярные маяки.