Бактериальная одногибридная система - Bacterial one-hybrid system

Рисунок 1: Обзор бактериальная одногибридная система. Библиотека рандомизированных нуклеотидов, представляющих потенциальные сайты связывания факторов транскрипции (10–20 пар оснований), «добычу», клонируется перед HIS3 и URA3, положительными и отрицательными селектируемыми маркерами, соответственно. Если фактор транскрипции связывается с рандомизированной областью, он рекрутирует РНК-полимеразу посредством прямого слияния с α- или ω-субъединицей и, таким образом, активирует транскрипцию нижестоящих репортерных генов. Используемый штамм E. coli-хозяина должен не иметь бактериальных гомологов этих биосинтетических генов (HIS3 и URA3).

В бактериальный моногибрид (B1H) система представляет собой метод идентификации последовательного целевого сайта ДНК-связывающий домен. В этой системе заданный фактор транскрипции (TF) выражается как слияние с субъединицей РНК-полимераза. Параллельно с этим библиотека рандомизированных олигонуклеотидов, представляющих потенциальные целевые последовательности TF, клонируется в отдельный вектор, содержащий выбираемые гены. HIS3 и URA3. Если ДНК-связывающий домен (приманка) связывает потенциальный сайт-мишень ДНК (жертва) in vivo, он привлечет РНК-полимеразу к промоутер и активировать транскрипция из репортерные гены в этом клоне. Два репортерных гена, HIS3 и URA3, позволяют проводить положительный и отрицательный отбор соответственно. В конце процесса положительные клоны секвенируют и исследуют с помощью инструментов поиска мотивов для определения предпочтительной целевой последовательности ДНК.[1]

Вступление

Через все живые организмы, регуляция экспрессии генов контролируется взаимодействиями между ДНК-связывающими регуляторными белками (факторами транскрипции) и цис-регуляторные элементы, Последовательности ДНК в генах или вокруг них, которые действуют как сайты-мишени для ДНК-связывающих белков. Связываясь с цис-регуляторными последовательностями и друг с другом, факторы транскрипции точно регулируют уровни транскрипции, стабилизируя / дестабилизируя связывание РНК-полимеразы с промотором гена, но, несмотря на их важность и повсеместность, мало что известно о том, где именно каждый из этих регуляторных белков связывает. Литература предполагает, что почти 8% генов человека кодируют факторы транскрипции, а функции и особенности их взаимодействий остаются в значительной степени неизученными.[2] Мы находимся на пороге конвергенции высокопроизводительных технологий и теории генома, которая позволяет исследователям начать картирование этих взаимодействий в масштабе всего генома. Только недавно была предпринята попытка полного обзора специфичности связывания ДНК для большого семейства ДНК-связывающих доменов. B1H - лишь один из многих новых методов, полезных для изучения взаимодействий белок-ДНК.[3]

Обзор метода

Рисунок 2: Одногибридная система бактерий требует двух настроенных плазмид: (а) вектор «приманки» (pB1H1 или pB1H2), который экспрессирует ДНК-связывающий домен в виде конструкции слияния с субъединицей (α или ω) РНК-полимеразы, и (b) репортерная плазмида (pH3U3), содержащая селектируемые маркеры и библиотеку сайтов связывания, или «жертву», которая потенциально будет взаимодействовать с «приманкой».

Трансформация бактериального хозяина с двумя разными плазмиды требуется. Один предназначен для экспрессии интересующего ДНК-связывающего белка в виде конструкции слияния с субъединицей РНК-полимеразы (приманка). Другая плазмида содержит область рандомизированной последовательности, представляющую потенциальные сайты связывания (жертвы), которые, если они связаны химерным продуктом слияния, вызывают экспрессию нижележащих репортерных генов. Эта репортерная область облегчает как положительный, так и отрицательный отбор с помощью HIS3 и URA3, соответственно, что вместе позволяет изолировать жертву, содержащую истинную последовательность-мишень ДНК. HIS3 и URA3 кодируют белки, необходимые для биосинтез гистидина и урацила.

Использование отрицательного селектируемого маркера имеет решающее значение для значительного снижения числа ложноположительных результатов. Самоактивирующаяся жертва, где рандомизированная область способствует экспрессии репортера в отсутствие связывания ТФ, удаляется путем трансформации библиотеки репортерного вектора в бактерии в отсутствие приманки и анализа роста на чашках, содержащих 5-фтороротовую кислоту (5- FOA). Белковый продукт URA3 превращает 5-FOA в токсичное соединение, тем самым обеспечивая выживание только тех колоний, которые содержат репортерные векторы, которые не самоактивируются. Отрицательный отбор обычно предшествует положительному отбору, так что меньшая очищенная библиотека жертв может быть подвергнута более строгому процессу положительного отбора. После трансформации очищенной библиотеки жертвы плазмидой-приманкой положительный отбор достигается путем выращивания хозяина. Кишечная палочка на минимальной среде без гистидина (селективная среда NM), которая обычно дополняется различными концентрациями 3-аминотриазола (3-AT), конкурентного ингибитора HIS3. HIS3 кодирует белок, необходимый для биосинтеза гистидина, и, таким образом, только те клетки, которые содержат комбинации приманка-жертва, которые активируют репортерные гены, смогут расти. Манипулирование концентрациями 3-AT позволяет характеризовать строгость связывания. Таким образом, исследователи могут оценить, насколько сильно приманка связывает свою жертву (коррелирует с уровнем экспрессии HIS3), и, таким образом, определить, какие участки связывания нуклеотидов имеют сильные или слабые предпочтения для данного основания. Другими словами, если клетки могут расти, несмотря на высокую концентрацию 3-AT, связывание приманка-жертва должно быть достаточно жестким, чтобы управлять экспрессией репортерного гена (HIS3) на достаточном уровне, чтобы преодолеть возникающее в результате конкурентное ингибирование. Наконец, положительные клоны секвенируют и исследуют с помощью существующих инструментов для поиска мотивов (например, MEME, BioProspector).[3]

История метода

Одногибридная система бактерий претерпела многочисленные модификации с момента ее создания в 2005 году.[3]В конечном итоге он возник как разновидность двугибридной системы бактерий, задуманной в 2000 году, которая сама была вдохновлена ​​одно- и двугибридной системами дрожжей.[4] В то время как двухгибридные версии могут оценивать как белок-белковое взаимодействие и белок-ДНК взаимодействия, одногибридная система специализируется на последнем. Система B1H Менга и др. отличается от двугибридной версии в двух ключевых отношениях. Он использует рандомизированную библиотеку жертв, состоящую из многих (<2x108) уникальные потенциальные последовательности-мишени, а также добавляет этап отрицательной селекции, чтобы очистить эту библиотеку от самоактивирующихся клонов.[1][3] Хотя эти идеи были заимствованы из исходной одногибридной дрожжевой системы,[5] они еще не применялись к бактериальному хозяину до 2005 года. По мере роста популярности метода исследователи внесли поправки в свои протоколы, чтобы улучшить систему B1H. Создание конструкции слияния (приманки) для омега-субъединицы, а не для альфа-субъединицы РНК-полимеразы в последнее время стало предпочтительным для улучшения стереохимии и динамического диапазона химеры.[6] А цинковый палец домен на слитой конструкции и соответствующий ему сайт-мишень ДНК, смежный с рандомизированной жертвой последовательностью, также были добавлены для увеличения аффинности и специфичности взаимодействий белок-ДНК. Эта повышенная общая аффинность связывания позволяет охарактеризовать даже те белки ДНК-связывающего домена, которые слабо взаимодействуют с последовательностью-мишенью.[7]

Рисунок 3: Обзор отрицательной и положительной процедуры отбора B1H. Сегмент ДНК, обозначенный «RR», относится к рандомизированной области на векторах-жертвах. Самоактивирующиеся последовательности удаляют из исходной библиотеки сайтов связывания, пытаясь вырастить трансформированную добычей E.coli на среде, содержащей 5-FOA, соединение, которое расщепляется до токсина с помощью URA3. Затем полученную очищенную библиотеку жертв трансформируют плазмидой-приманкой и выращивают на минимальной среде без гистидина для положительного отбора активно экспрессируемых репортерных векторов. В эту среду добавляют различные концентрации 3-AT, конкурентного ингибитора HIS3, для выяснения аффинности связывания фактора транскрипции с каждой конкретной последовательностью-мишенью. Затем рандомизированные области из выживших колоний выделяют и секвенируют перед анализом нахождения мотивов (например, MEME, BioProspector). Наконец, создаются оптимальные и допустимые основания в ключевых положениях сайта связывания.

.

Преимущества

Система B1H имеет значительные преимущества перед другими методами исследования взаимодействий белок-ДНК. Микрочип -счет иммунопреципитации хроматина (ЧИП-чип ) для высокопроизводительного определения сайта связывания полагается на специфические антитела, которые не всегда могут быть доступны. Методы, основанные на белков-связывающих микрочипах, также требуют дополнительных этапов очистки белка, которые не требуются в системе B1H. Кроме того, эти методы на основе микрочипов часто являются недопустимыми с точки зрения необходимости специальных средств и опыта для анализа полученных данных. SELEX, другая система, обычно используемая для идентификации нуклеиновых кислот-мишеней для ДНК-связывающих белков, требует многократного отбора. Напротив, бактериальная одногибридная система требует всего одного раунда отбора in vitro и также предлагает низкотехнологичную альтернативу технологиям на основе микрочипов. Антитела не требуются для изучения взаимодействий ДНК-связывающих белков в системе B1H. Еще одно преимущество состоит в том, что система B1H работает не только с мономерными белками, но и с белками, которые связывают ДНК в виде комплексов. Систему B1H следует рассматривать как специализированный метод изучения взаимодействий ДНК-белок, тогда как двухгибридные варианты (B2H и Y2H ) может оценивать как взаимодействия белок-белок, так и белок-ДНК. Эти двухгибридные системы являются многоцелевыми, но ограничены с точки зрения анализа только одной библиотеки «жертвы». Преимущество бактериальной одногибридной системы над дрожжевой одногибридной системой (Y1H) заключается в более высокой эффективности трансформации плазмид в бактерии, что позволяет исследовать более сложные библиотеки «жертвы».[1][3]

Ограничения

Несмотря на вышеупомянутые преимущества как специализированного инструмента, система B1H имеет некоторые недостатки. Во-первых, система отбора B1H ограничена в своей способности определять специфичность связывания факторов транскрипции с длинными сайтами связывания. Это происходит из-за того, что количество рандомизированных клонов «жертвы», необходимых для представления всех возможных последовательностей-мишеней, увеличивается экспоненциально с количеством нуклеотидов в этой последовательности-мишени. Во-вторых, некоторые эукариотические факторы могут не экспрессироваться или эффективно складываться в бактериальной системе, что связано с различными регуляторными сетями и транскрипционным механизмом. Следовательно, при работе с ДНК-связывающими белками эукариотического происхождения может оказаться полезной гибридная система на основе дрожжей. В-третьих, система B1H может не идеально подходить для факторов транскрипции, которые распознают сайты связывания с низким сродством. Логика здесь состоит в том, что конкуренция, создаваемая сайтами связывания в другом месте бактериального генома, может ограничивать сигнал, который может быть реализован от одного сайта связывания, который присутствует перед репортером.[1][3]

Заявление

Система B1H предоставляет инструмент в нашем арсенале для определения специфичности связывания ДНК факторов транскрипции и, таким образом, прогнозирования их генов-мишеней и регуляторных элементов геномной ДНК. Это также позволяет исследовать эффекты белок-белковых взаимодействий на связывание ДНК, что может в дальнейшем направлять предсказание цис-регуляторных модулей на основе кластеризации сайтов связывания. Более того, система отбора B1H имеет значение для предсказания регуляторных ролей ранее не охарактеризованных факторов транскрипции.[1]

Конкретные примеры

Используя бактериальную одногибридную систему, одно исследование охарактеризовало 35 членов сети сегментации Drosophilia melanogaster, которая включает представителей всех основных классов белков ДНК-связывающих доменов.[8] Значение для медицинских исследований очевидно из другого исследования, в котором система B1H использовалась для определения специфичности связывания ДНК транскрипционного регулятора для гена в Микобактерии туберкулеза.[9] Система B1H также использовалась для идентификации важного элемента обмена у Escherichia coli.[10]

внешняя ссылка

Рекомендации

  1. ^ а б c d е Булык М (2005). «Открытие регуляторных элементов ДНК с помощью бактерий». Природа Биотехнологии. 23 (8): 942–944. Дои:10.1038 / nbt0805-942. ЧВК  2720157. PMID  16082362.
  2. ^ Мессина Д. Н., Гласскок Дж., Гиш В., Ловетт М. (2004). «Анализ генов факторов транскрипции человека на основе ORFeome и создание микроматрицы для исследования их экспрессии». Геномные исследования. 14 (2004): 2041–2047. Дои:10.1101 / гр.2584104. ISSN  1088-9051. ЧВК  528918. PMID  15489324.
  3. ^ а б c d е ж Менг X, Вулф С.А. (2006). «Идентификация последовательностей ДНК, распознаваемых фактором транскрипции, с использованием бактериальной одногибридной системы». Протоколы природы. 1 (1): 30–45. Дои:10.1038 / nprot.2006.6. PMID  17406209.
  4. ^ Джунг Дж. К., Рамм Э. Л., Пабо КО (2000). «Бактериальная двухгибридная селекционная система для изучения белок-ДНК и белок-белковых взаимодействий». PNAS. 97 (13): 7382–7387. Дои:10.1073 / pnas.110149297. ЧВК  16554. PMID  10852947.
  5. ^ Уилсон Т.Е., Фарнер Т.Дж., Джонстон М., Милбрант Дж. (1991). «Идентификация сайта связывания ДНК для NGFI-B путем генетической селекции у дрожжей». Наука. 252 (5010): 1296–1300. Дои:10.1126 / наука.1925541. PMID  1925541.
  6. ^ Нойес МБ, Кристенсен Р.Г., Вакабаяши А., Стормо Г.Д., Бродский М.Х., Вулф С.А. (2006). «Анализ особенностей гомеодомена позволяет предсказывать предпочтительные места узнавания в масштабах всей семьи». Клетка. 133 (2008): 1277–1289. Дои:10.1016 / j.cell.2008.05.023. ЧВК  2478728. PMID  18585360.
  7. ^ Дурай С., Босли А., Абуленсия А.Б., Чандрасегаран С., Остермайер М. (2006). «Бактериальная система селекции One-Hybrid для исследования взаимодействий цинка Fingure_DNA». Комбинаторная химия и высокопроизводительный скрининг. 9 (2006): 301–311. Дои:10.2174/138620706776843147.
  8. ^ Нойес МБ, Мэн Х, Вакабаяши А., Синха С., Бродский М.Х., Вулф С.А. (2008). «Систематическая характеристика факторов, которые регулируют сегментацию дрозофилы с помощью бактериальной одногибридной системы». Исследования нуклеиновых кислот. 36 (8): 2547–2560. Дои:10.1093 / nar / gkn048. ЧВК  2377422. PMID  18332042.
  9. ^ Го М., Фэн Х, Чжан Дж, Ван В, Ван Дж, Ли И, Гао Ц, Чен Х, Фэн Й, Хе З. Г. (2009). «Рассечение путей регуляции транскрипции с помощью новой бактериальной одногибридной репортерной системы». Геномные исследования. 19 (7): 1301–8. Дои:10.1101 / гр.086595.108. ЧВК  2704442. PMID  19228590.
  10. ^ Обрист М, Нарберхаус Ф (2005). «Идентификация элемента оборота в области 2.1 Escherichia coli 32 с помощью бактериального одногибридного подхода». Журнал бактериологии. 187 (11): 3807–3813. Дои:10.1128 / JB.187.11.3807-3813.2005. ЧВК  1112070. PMID  15901705.