Секвенатор ДНК - DNA sequencer

Секвенсор ДНК
ДНК-секвенаторы с Flickr 57080968.jpg
Секвенаторы ДНК
ПроизводителиРош, Иллюмина, Технологии жизни, Бекман Коултер, Тихоокеанские биологические науки, MGI / BGI, Oxford Nanopore Technologies

А Секвенатор ДНК это научный инструмент используется для автоматизации Секвенирование ДНК обработать. Учитывая образец ДНК, секвенатор ДНК используется для определения порядка четырех оснований: G (гуанин ), C (цитозин ), А (аденин ) и т (тимин ). Затем об этом сообщается в виде текста строка, называется прочитанным. Некоторые секвенаторы ДНК также можно рассматривать оптические инструменты поскольку они анализируют световые сигналы, исходящие от флуорохромы прикреплен к нуклеотиды.

Первый автоматический секвенатор ДНК, изобретенный Ллойд М. Смит, был представлен Прикладные биосистемы в 1987 г.[1] Он использовал Секвенирование по Сэнгеру метод, технология, которая легла в основу «первого поколения» секвенаторов ДНК.[2][3] и позволил завершить проект генома человека в 2001.[4] Это первое поколение секвенаторов ДНК по существу автоматизировано. электрофорез системы, обнаруживающие миграцию меченых фрагментов ДНК. Следовательно, эти секвенсоры также можно использовать в генотипирование генетических маркеров, для которых необходимо определить только длину фрагмента (ов) ДНК (например, микроспутники, AFLP ).

В Проект "Геном человека" стимулировали разработку более дешевых, высокопроизводительных и точных платформ, известных как Секвенсоры нового поколения (NGS) для последовательности человеческий геном. К ним относятся 454, СОЛИД и Иллюмина Платформы для секвенирования ДНК. Машины секвенирования нового поколения существенно увеличили скорость секвенирования ДНК по сравнению с предыдущими методами Сэнгера. Образцы ДНК можно приготовить автоматически всего за 90 минут,[5] а геном человека можно секвенировать с 15-кратным охватом всего за несколько дней.[6]

Более поздние секвенаторы третьего поколения, такие как SMRT и Оксфорд Нанопор измерять добавление нуклеотидов к одной молекуле ДНК в режиме реального времени.

Из-за ограничений технологии секвенатора ДНК эти чтения короткие по сравнению с длиной геном поэтому чтения должны быть собранный в более длинный контиги.[7] Данные также могут содержать ошибки, вызванные ограничениями в методике секвенирования ДНК или ошибками во время ПЦР-амплификация. Производители секвенаторов ДНК используют ряд различных методов для определения присутствующих оснований ДНК. Конкретные протоколы, применяемые на разных платформах секвенирования, влияют на генерируемые окончательные данные. Поэтому сравнение качества и стоимости данных по разным технологиям может быть сложной задачей. Каждый производитель предоставляет свои собственные способы информирования об ошибках секвенирования и баллах. Однако ошибки и оценки между разными платформами не всегда можно напрямую сравнивать. Поскольку в этих системах используются разные подходы к секвенированию ДНК, выбор лучшего секвенатора и метода ДНК обычно зависит от целей эксперимента и доступного бюджета.[2]

История

Первый Секвенирование ДНК методы были разработаны Гилбертом (1973)[8] и Сэнгер (1975).[9] Гилберт представил метод секвенирования, основанный на химической модификации ДНК с последующим расщеплением по определенным основаниям, тогда как метод Сэнгера основан на дидезоксинуклеотид обрыв цепи. Метод Сенгера стал популярным благодаря своей повышенной эффективности и низкой радиоактивности. Первым автоматическим секвенатором ДНК был AB370A, представленный в 1986 г. Прикладные биосистемы. AB370A был способен секвенировать 96 образцов одновременно, 500 килобаз в день и достигая длины считывания до 600 оснований. Это было началом «первого поколения» секвенаторов ДНК,[2][3] в котором реализовано секвенирование по Сэнгеру, флуоресцентные дидезоксинуклеотиды и полиакриламидный гель, расположенный между стеклянными пластинами - пластинчатыми гелями. Следующим крупным достижением стал выпуск в 1995 году AB310, в котором для разделения цепей ДНК с помощью электрофореза использовался линейный полимер в капилляре вместо пластинчатого геля. Эти методы легли в основу завершения проекта генома человека в 2001 году.[4] Проект генома человека стимулировал разработку более дешевых, высокопроизводительных и точных платформ, известных как секвенсоры нового поколения (NGS). В 2005 году, 454 Науки о жизни выпустила секвенатор 454, за которым последовали Solexa Genome Analyzer и SOLiD (Supported Oligo Ligation Detection) от Agencourt в 2006 году. Applied Biosystems приобрела Agencourt в 2006 году, а в 2007 году, Рош купила 454 Life Sciences, а Illumina купила Solexa. Ion Torrent вышел на рынок в 2010 году и был приобретен компанией Life Technologies (ныне Thermo Fisher Scientific). И BGI начал производство секвенсоров в Китае после приобретения Полная геномика под их MGI рука. Это по-прежнему самые распространенные системы NGS из-за их конкурентоспособной стоимости, точности и производительности.

Совсем недавно было представлено третье поколение секвенаторов ДНК. Методы секвенирования, применяемые этими секвенаторами, не требуют амплификации ДНК (полимеразная цепная реакция - ПЦР), что ускоряет подготовку образца перед секвенированием и снижает количество ошибок. Кроме того, данные секвенирования собираются по реакциям, вызванным добавлением нуклеотидов в комплементарную цепь в реальном времени. Две компании представили разные подходы в своих секвенаторах третьего поколения. Тихоокеанские биологические науки Секвенсоры используют метод, называемый «Одномолекулярный в реальном времени» (SMRT), где данные секвенирования производятся с помощью света (захваченного камерой), излучаемого, когда нуклеотид добавляется к комплементарной цепи ферментами, содержащими флуоресцентные красители. Oxford Nanopore Technologies - еще одна компания, разрабатывающая секвенсоры третьего поколения с использованием электронных систем, основанных на технологиях обнаружения нанопор.

Производители секвенаторов ДНК

Секвенсоры ДНК были разработаны, изготовлены и проданы, в частности, следующими компаниями.

Рош

Секвенатор ДНК 454 стал первым коммерчески успешным секвенатором нового поколения.[10] Он был разработан 454 Life Sciences и приобретен компанией Roche в 2007 году. 454 использует обнаружение пирофосфата, высвобождаемого в результате реакции ДНК-полимеразы, при добавлении нуклеотида к матричному штамму.

В настоящее время Roche производит две системы на основе своей технологии пиросеквенирования: GS FLX + и GS Junior System.[11] Система GS FLX + обещает длину считывания примерно 1000 пар оснований, в то время как система GS Junior обещает считывание 400 пар оснований.[12][13] Предшественник GS FLX +, система 454 GS FLX Titanium была выпущена в 2008 году, обеспечивая выход 0,7 ГБ данных за цикл, с точностью 99,9% после качественного фильтра и длиной считывания до 700 бит / с. В 2009 году Roche выпустила GS Junior, настольную версию секвенсора 454 с длиной считывания до 400 пар оснований и упрощенной подготовкой библиотеки и обработкой данных.

Одним из преимуществ систем 454 является их скорость работы, количество рабочих рук может быть уменьшено за счет автоматизации подготовки библиотеки и полуавтоматизации эмульсионной ПЦР. Недостатком системы 454 является то, что она склонна к ошибкам при оценке числа оснований в длинной цепочке идентичных нуклеотидов. Это называется ошибкой гомополимера и возникает, когда в ряду 6 или более одинаковых оснований.[14] Еще один недостаток заключается в том, что реагенты стоят относительно дороже по сравнению с другими секвенаторами следующего поколения.

В 2013 году компания Roche объявила, что прекратит разработку 454 технологий и полностью выведет из эксплуатации 454 машины в 2016 году.[15][16]

Рош производит ряд программных инструментов, оптимизированных для анализа 454 данных секвенирования.[17] Процессор GS Run[18] преобразует необработанные изображения, созданные в ходе секвенирования, в значения интенсивности. Процесс состоит из двух основных этапов: обработки изображения и обработки сигнала. Программное обеспечение также применяет нормализацию, коррекцию сигнала, базовый вызов и оценки качества для отдельных считываний. Программное обеспечение выводит данные в файлах стандартного формата блок-схемы (или SFF) для использования в приложениях анализа данных (GS De Novo Assembler, GS Reference Mapper или GS Amplicon Variant Analyzer). GS De Novo Assembler - это инструмент для de novo сборка полных геномов размером до 3 ГБ из считываний по отдельности или в сочетании с парными конечными данными, генерируемыми 454 секвенсорами. Он также поддерживает сборку транскриптов de novo (включая анализ), а также обнаружение вариантов изоформы.[17] GS Reference Mapper сопоставляет короткие чтения с эталонным геномом, генерируя согласованную последовательность. Программное обеспечение может генерировать выходные файлы для оценки с указанием вставок, удалений и SNP. Может обрабатывать большие и сложные геномы любого размера.[17] Наконец, анализатор вариантов GS Amplicon сопоставляет показания образцов ампликона с эталоном, идентифицируя варианты (связанные или нет) и их частоту. Его также можно использовать для обнаружения неизвестных и низкочастотных вариантов. Включает графические инструменты для анализа трасс.[17]

Иллюмина

Секвенатор Illumina Genome Analyzer II

Иллюмина производит ряд секвенсорных машин следующего поколения с использованием технологий, приобретенных у Прогнозирующая медицина Manteia и разработан Solexa.[19] Illumina производит ряд секвенирующих машин следующего поколения, использующих эту технологию, включая HiSeq, Genome Analyzer IIx, MiSeq и HiScanSQ, которые также могут обрабатывать микрочипы.[20]

Технология, ведущая к этим секвенаторам ДНК, была впервые выпущена Solexa в 2006 году как анализатор генома.[10] Illumina приобрела Solexa в 2007 году. В анализаторе генома используется метод секвенирования путем синтеза. Первая модель производила 1 Гбайт за пробег. В 2009 году объем производства был увеличен с 20 Гбайт в августе до 50 Гбайт в декабре. В 2010 году Illumina выпустила HiSeq 2000 с выходной мощностью 200, а затем 600 Гбайт на цикл, что заняло бы 8 дней. На момент своего выпуска HiSeq 2000 предоставляла одну из самых дешевых платформ для секвенирования по цене 0,02 доллара за миллион оснований по расчетам Пекинский институт геномики.

В 2011 году Illumina выпустила настольный секвенсор под названием MiSeq. На момент выпуска MiSeq мог генерировать 1,5 Гб за прогон с парными чтениями в конце 150 бит / с. Цикл секвенирования может быть выполнен за 10 часов при использовании автоматической подготовки образцов ДНК.[10]

Illumina HiSeq использует два программных инструмента для расчета количества и положения кластеров ДНК для оценки качества секвенирования: систему управления HiSeq и анализатор в реальном времени. Эти методы помогают оценить, мешают ли соседние скопления друг другу.[10]

Технологии жизни

Технологии жизни (теперь Thermo Fisher Scientific) производит секвенаторы ДНК под Прикладные биосистемы и Ион Торрент бренды. Applied Biosystems создает платформу для секвенирования нового поколения SOLiD,[21] и секвенаторы ДНК на основе Сэнгера, такие как генетический анализатор 3500.[22] Под брендом Ion Torrent компания Applied Biosystems производит четыре секвенсора следующего поколения: систему Ion PGM, систему Ion Proton, систему Ion S5 и Ion S5xl.[23] Предполагается, что компания также разрабатывает свой новый секвенатор капиллярной ДНК под названием SeqStudio, который будет выпущен в начале 2018 года.[24]

SOLiD systems была приобретена Applied Biosystems в 2006 году. SOLiD применяет секвенирование путем лигирования и двойное базовое кодирование. Первая система SOLiD была запущена в 2007 году и генерировала данные с длиной считывания 35 бит / с за один прогон. После пяти обновлений в 2010 году была выпущена система секвенирования 5500xl, значительно увеличившая длину считывания до 85 бит / с, повышая точность до 99,99% и производя 30 ГБ за 7-дневный прогон.[10]

Ограниченная длина чтения SOLiD остается существенным недостатком.[25] и до некоторой степени ограничил свое использование экспериментами, где длина считывания менее важна, такими как повторное секвенирование и анализ транскриптома, а также недавние эксперименты с ChIP-Seq и метилированием.[10] Время подготовки образцов ДНК для систем SOLiD стало намного меньше благодаря автоматизации подготовки библиотек для секвенирования, такой как система Tecan.[10]

Данные цветового пространства, созданные платформой SOLiD, могут быть декодированы в основы ДНК для дальнейшего анализа, однако программное обеспечение, которое учитывает исходную информацию о цветовом пространстве, может дать более точные результаты. Life Technologies выпустила BioScope,[26] пакет анализа данных для повторного секвенирования, ChiP-Seq и анализа транскриптома. Он использует алгоритм MaxMapper для сопоставления чтения цветового пространства.

Бекман Коултер

Бекман Коултер (сейчас же Данахер ) ранее производила секвенаторы ДНК на основе терминации цепи и капиллярного электрофореза под названием CEQ, включая CEQ 8000. В настоящее время компания производит систему генетического анализа GeXP, в которой используется секвенирование терминатора красителя. В этом методе используется термоциклер во многом так же, как ПЦР для денатурирования, отжига и удлинения фрагментов ДНК, амплификации секвенированных фрагментов.[27][28]

Тихоокеанские биологические науки

Тихоокеанские биологические науки производит системы секвенирования PacBio RS и Sequel, используя секвенирование одной молекулы в реальном времени, или SMRT, метод.[29] Эта система может производить считанные длины в несколько тысяч пар оснований. Более высокие необработанные ошибки чтения исправляются либо с использованием кругового консенсуса, когда одна и та же цепочка читается снова и снова, либо с использованием оптимизированного сборка стратегии.[30] Ученые сообщили о точности 99,9999% этих стратегий.[31] Система Sequel была запущена в 2015 году с увеличенной емкостью и более низкой ценой.[32][33]

Секвенсор Oxford Nanopore MinION (внизу справа) использовался астронавтом при первом в истории секвенировании ДНК в космосе в августе 2016 года. Кэтлин Рубинс.[34]

Оксфорд Нанопор

Oxford Nanopore Technologies начал поставки ранних версий своего секвенирование нанопор Секвенсор MinION для выбранных лабораторий. Устройство имеет длину четыре дюйма и питается от Порт USB. MinION декодирует ДНК напрямую, когда молекула протягивается со скоростью 450 оснований в секунду через нанопора подвешен в мембране. Изменения электрического тока показывают, какая база присутствует. Его точность составляет от 60 до 85 процентов по сравнению с 99,9 процентами в обычных машинах. Даже неточные результаты могут оказаться полезными, потому что это приводит к большой длине чтения. GridION - это немного больший секвенсор, который обрабатывает до пяти проточных ячеек MinION одновременно. PromethION - еще один (неизданный) продукт, который будет использовать до 100000 пор параллельно, что больше подходит для секвенирования большого объема.[35]

Сравнение

Текущие предложения в области технологии секвенирования ДНК показать доминирующего игрока: Иллюмина (Декабрь 2019 г.), а затем PacBio, MGI / BGI и Оксфорд Нанопор.

Сравнение показателей и производительности секвенаторов ДНК нового поколения.[36]
СеквенсорИон Торрент PGM [5][37][38]454 GS FLX [10]HiSeq 2000 [5][10]SOLiDv4 [10]PacBio [5][39]Sanger 3730xl [10]
ПроизводительИон Торрент (Life Technologies)454 Науки о жизни (Рош)ИллюминаПрикладные биосистемы (Life Technologies)Тихоокеанские биологические наукиПрикладные биосистемы (Life Technologies)
Секвенирование химииИонно-полупроводниковое секвенированиеПиросеквенированиеПоследовательность за синтезом на основе полимеразыСеквенирование на основе лигированияФосфосвязанные флуоресцентные нуклеотидыОбрыв цепи дидезокси
Подход к амплификацииЭмульсионная ПЦРПЦР эмульсииМостовое усилениеПЦР эмульсииОдномолекулярный; без усиленияПЦР
Вывод данных за запуск100-200 Мб0,7 Гб600 Гб120 Гб0,5 - 1,0 ГБ1.9∼84 Кб
Точность99%99.9%99.9%99.94%88,0% (> 99,9999% CCS или HGAP)99.999%
Время на запускдва часа24 часа3–10 дней7–14 дней2–4 часа20 минут - 3 часа
Прочитать длину200-400 п.н.700 п.н.Парный конец 100x100 п.н.Парный конец 50x50 п.н.14000 б.п. (N50 )400-900 п.н.
Стоимость за запуск350 долларов США7000 долларов США6000 долларов США (30x геном человека)4000 долларов США125–300 долларов США4 доллара США (одно чтение / реакция)
Стоимость за Мб1 доллар США10 долларов США0,07 доллара США0,13 доллара США0,13–0,60 доллара США2400 долларов США
Стоимость за инструмент80 000 долларов США500 000 долларов США690 000 долларов США495 000 долларов США695 000 долларов США95 000 долларов США

использованная литература

  1. ^ Кук-Диган, Роберт Маллан (1991). "Истоки проекта" Геном человека ". Журнал FASEB. Вашингтонский университет. 5 (1): 8–11. Дои:10.1096 / fasebj.5.1.1991595. PMID  1991595. S2CID  37792736. Получено 20 октября 2014.
  2. ^ а б c Мецкер, М. Л. (2005). «Новые технологии в секвенировании ДНК». Genome Res. 15 (12): 1767–1776. Дои:10.1101 / гр.3770505. PMID  16339375.
  3. ^ а б Хатчисон, К.А. III. (2007). «Секвенирование ДНК: от лаборатории до постели и не только». Нуклеиновые кислоты Res. 35 (18): 6227–6237. Дои:10.1093 / нар / гкм688. ЧВК  2094077. PMID  17855400.
  4. ^ а б Ф. С. Коллинз; М. Морган; А. Патринос (2003). «Проект« Геном человека »: уроки крупномасштабной биологии». Наука. 300 (5617): 286–290. Bibcode:2003Наука ... 300..286C. Дои:10.1126 / science.1084564. PMID  12690187. S2CID  22423746.
  5. ^ а б c d Майкл А Куэйл, Мириам Смит, Пол Коупленд, Томас Д Отто, Саймон Р. Харрис, Томас Р. Коннор, Анна Бертони, Гарольд П. Свердлоу и Ён Гу (2012) Рассказ о трех платформах секвенирования следующего поколения: сравнение секвенсоров Ion Torrent, Pacific Biosciences и Illumina MiSeq. BMC Genomics.
  6. ^ Майкл А. Куэйл; Иванка Козарева; Фрэнсис Смит; Эйлвин Скалли; Филип Дж. Стивенс; Ричард Дурбин; Гарольд Свердлоу; Дэниел Дж. Тернер (2008). «Усовершенствования крупного центра генома в системе секвенирования Illumina». Нат методы. 5 (12): 1005–1010. Дои:10.1038 / nmeth.1270. ЧВК  2610436. PMID  19034268.
  7. ^ Хэн Ли, Цзюэ Руан и Ричард Дурбин (2008) http://genome.cshlp.org/content/18/11/1851 Отображение считывания коротких последовательностей ДНК и вызова вариантов с использованием показателей качества картирования. Геномные исследования.
  8. ^ Гилберт В., Максам А. (1973). «Нуклеотидная последовательность оператора lac». Proc Natl Acad Sci U S A. 70 (12): 13581–3584. Bibcode:1973PNAS ... 70.3581G. Дои:10.1073 / pnas.70.12.3581. ЧВК  427284. PMID  4587255.
  9. ^ Сэнгер Ф., Колсон А.Р. (май 1975 г.). «Экспресс-метод определения последовательностей в ДНК путем примированного синтеза с ДНК-полимеразой». J. Mol. Биол. 94 (3): 441–8. Дои:10.1016/0022-2836(75)90213-2. PMID  1100841.
  10. ^ а б c d е ж г час я j k Линь Лю; Иньху Ли; Силианг Ли; Ни Ху; Иминь Хэ; Рэй Понг; Данни Линь; Лихуа Лу; Мэгги Лоу (2012). «Сравнение систем секвенирования нового поколения». Журнал биомедицины и биотехнологии. 2012: 251364. Дои:10.1155/2012/251364. ЧВК  3398667. PMID  22829749.
  11. ^ «Продукция: 454 Life Sciences, компания Рош». Архивировано из оригинал на 2012-09-13. Получено 2012-09-05.
  12. ^ «Продукция - Система GS FLX +: 454 Life Sciences, компания Roche». Архивировано из оригинал на 2012-09-05. Получено 2012-09-05.
  13. ^ «Продукция - GS Junior System: 454 Life Sciences, компания Roche». Архивировано из оригинал на 2012-09-13. Получено 2012-09-05.
  14. ^ Мардис, Элейн Р. (1 сентября 2008 г.). «Методы секвенирования ДНК следующего поколения». Ежегодный обзор геномики и генетики человека. 9 (1): 387–402. Дои:10.1146 / annurev.genom.9.081307.164359. PMID  18576944. S2CID  2484571.
  15. ^ http://www.genomeweb.com/sequencing/roche-shutting-down-454-sequencing-business Рош закрывает бизнес по секвенированию 454
  16. ^ http://www.bio-itworld.com/2013/4/23/roche-shuts-down-third-generation-ngs-research-programs.html Roche закрывает исследовательские программы NGS третьего поколения
  17. ^ а б c d «Продукты - Программное обеспечение для анализа: 454 Life Science, компания Roche». Архивировано из оригинал 19 февраля 2009 г.. Получено 2013-10-23.
  18. ^ Руководство по системному программному обеспечению Genome Sequencer FLX, версия 2.3
  19. ^ Прогресс Solexa в генах - Businessweek
  20. ^ Illumina Systems
  21. ^ СОЛИД
  22. ^ Секвенирование по Сэнгеру | Технологии жизни
  23. ^ http://www.thermofisher.com/iontorrent Ион Торрент
  24. ^ «Генетический анализатор Applied Biosystems SeqStudio - США».
  25. ^ Точность системы SOLiD
  26. ^ Программное обеспечение SOLiD BioScope | Технологии жизни
  27. ^ Рай, Алекс Дж .; Каматх, Рашми М .; Джеральд, Уильям; Флейшер, Мартин (29 октября 2008 г.). «Аналитическая проверка анализатора GeXP и разработка рабочего процесса для обнаружения биомаркеров рака с использованием мультиплексированного профилирования экспрессии генов». Аналитическая и биоаналитическая химия. 393 (5): 1505–1511. Дои:10.1007 / s00216-008-2436-7. PMID  18958454. S2CID  46721686.
  28. ^ Beckman Coulter, Inc - Система генетического анализа GenomeLab GeXP
  29. ^ Pacific Biosciences: PacBio Systems
  30. ^ Корен, S; Schatz, MC; Валенц, ВР; Мартин, Дж; Ховард, JT; Ганапати, G; Ван, З; Раско Д.А.; Маккомби, WR; Джарвис, ЭД; Филлиппи, AM (1 июля 2012 г.). «Гибридная коррекция ошибок и сборка de novo считывает секвенирование одной молекулы». Природа Биотехнологии. 30 (7): 693–700. Дои:10.1038 / nbt.2280. ЧВК  3707490. PMID  22750884.
  31. ^ Чин, Чен-Шань; Александр, Дэвид Х .; Маркс, Патрик; Кламмер, Аарон А .; Дрейк, Джеймс; Хайнер, Шерил; Клам, Алисия; Коупленд, Алекс; Хаддлстон, Джон; Эйхлер, Эван Э .; Тернер, Стивен У .; Корлач, Йонас (2013). «Негибридные, готовые сборки микробного генома на основе данных секвенирования SMRT с длинным считыванием». Методы природы. 10 (6): 563–569. Дои:10.1038 / nmeth.2474. PMID  23644548. S2CID  205421576.
  32. ^ «Мир Био-ИТ».
  33. ^ «PacBio запускает высокопроизводительную и недорогую систему секвенирования одной молекулы».
  34. ^ Гаскилл, Мелисса (29 августа 2016 г.). «Первое секвенирование ДНК в космосе, которое меняет правила игры». НАСА. Получено 26 октября, 2016.
  35. ^ Регаладо, Антонио (17 сентября 2014 г.). «Радикально новый секвенсор ДНК наконец попал в руки исследователей». Обзор технологий. Получено 3 октября, 2014.
  36. ^ Shendure, J .; Джи, Х. (2008). «Секвенирование ДНК нового поколения». Nat. Биотехнология. 26 (10): 1135–1145. Дои:10.1038 / nbt1486. PMID  18846087. S2CID  6384349.
  37. ^ Кароу, Дж. (2010) Ion Torrent Systems представляет электронный секвенсор стоимостью 50 000 долларов на AGBT. По порядку.
  38. ^ «Ион ПГМ - Ион Торрент». Архивировано из оригинал на 2012-09-20. Получено 2013-02-13.
  39. ^ Тихоокеанские биологические науки