Активация транскрипции, контролируемая тетрациклином - Tetracycline-controlled transcriptional activation

Пример системы T-REx, контролирующей экспрессию shRNA

Активация транскрипции, контролируемая тетрациклином метод индуцибельного экспрессия гена куда транскрипция реверсивно включается или выключается при наличии антибиотик тетрациклин или одна из его производных (например, доксициклин ).[1]

Экспрессия гена, контролируемая тетрациклином, основана на механизме устойчивости к лечению тетрациклиновыми антибиотиками, обнаруженного в Грамотрицательные бактерии. В природе Pтет промоутер выражает TetR, репрессор и TetA, белок, который выкачивает тетрациклиновый антибиотик из клетки.[2]

Разница между Tet-On и Tet-Off не в том, включает или выключает трансактиватор ген, как следует из названия; скорее, оба белка активировать выражение. Разница связана с их реакцией на тетрациклин или доксициклин (Докс, более стабильный аналог тетрациклина); Tet-Off активизирует экспрессию в отсутствие Dox, тогда как Tet-On активируется в присутствие из Dox.

Тет-офф и Тет-он

Две наиболее часто используемые индуцибельные системы экспрессии для исследования биологии эукариотических клеток называются Tet-Off и Tet-On.[3] Система Tet-Off для контроля экспрессии представляющих интерес генов в клетках млекопитающих была разработана профессорами. Германн Бухар и Манфред Госсен на Гейдельбергский университет и впервые опубликовано в 1992 году.[4]

В системе Tet-Off используется трансактиватор тетрациклина (tTA) белок, который создается путем слияния одного белок, TetR (репрессор тетрациклина), обнаруженный в кишечная палочка бактерии с доменом активации другого белка, VP16, найденный в Вирус простого герпеса.[5]

Полученный в результате белок tTA способен связываться с ДНК в определенных TetO оператор последовательности. В большинстве систем Tet-Off несколько повторов таких последовательностей TetO размещаются перед минимальный промоутер такой как Промотор CMV. Совокупность нескольких последовательностей TetO с минимальным промотором называется элемент ответа на тетрациклин (TRE), поскольку он реагирует на связывание белка трансактиватора тетрациклина tTA увеличением экспрессии гена или генов, расположенных ниже его промотора.

В системе Tet-Off экспрессия TRE-контролируемых генов может подавляться тетрациклином и его производными. Они связывают tTA и делают его неспособным связываться с последовательностями TRE, тем самым предотвращая трансактивацию TRE-контролируемых генов.

Система Tet-On работает аналогично, но в противоположном направлении. В системе Tet-Off tTA может связывать оператора только если нет связанный с тетрациклином или одним из его производных, таким как доксициклин, в системе Tet-On, белок rtTA способен связывать оператора только если связаны тетрациклином. Таким образом, введение доксициклина в систему инициирует транскрипцию генетического продукта. Систему Tet-On иногда предпочитают Tet-Off из-за ее более быстрого реагирования.

Тет-офф системы экспрессии также используются для создания трансгенных мышей, которые условно экспрессируют интересующий ген.

Tet-On Advanced и Tet-On 3G

Трансактиватор Tet-On Advanced (также известный как rtTA2S-M2) представляет собой альтернативную версию Tet-On, которая демонстрирует пониженную базальную экспрессию и функционирует при концентрации Dox в 10 раз ниже, чем Tet-Off. Кроме того, его экспрессия считается более стабильной в эукариотических клетках из-за того, что человеческий кодон оптимизирован и используя 3 минимальных домена активации транскрипции. Он был открыт в 2000 году как один из двух улучшенных мутантов Х. Бухардом и его коллегами после случайного мутагенеза части Tet Repressor гена трансактиватора.[6] Tet-On 3G (также известный как rtTA-V10 [7]) похож на Tet-On Advanced, но был получен из rtTA2S-S2 вместо rtTA2S-M2. Он также оптимизирован по кодонам человека и состоит из 3 минимальных доменов активации VP16. Тем не менее, белок Tet-On 3G имеет 5 аминокислотных отличий от Tet-On Advanced, что, по-видимому, еще больше увеличивает его чувствительность к Dox. Tet-On 3G чувствителен к Dox в 100 раз меньше и в 7 раз активнее, чем исходный Tet-On.[8]

Другие системы

Другие системы, такие как система T-REx от Life Technologies, работают иначе.[9] Представляющий интерес ген фланкирован вышестоящим промотором CMV и двумя сайтами TetO2. Экспрессия интересующего гена подавляется высоким сродством связывания гомодимеров TetR с каждой последовательностью TetO2 в отсутствие тетрациклина. Введение тетрациклина приводит к связыванию одного тетрациклина с каждым гомодимером TetR с последующим высвобождением TetO2 гомодимерами TetR. Несвязывание гомодимеров TetR и TetO2 приводит к дерепрессии интересующего гена.

Модифицированная версия T-REx - это линеаризатор. синтетическая биологическая цепь, оптимизированный для настройки экспрессии генов в эукариотических (почкующиеся дрожжи, человеческие и т. д.) клетках. Встраивая сайты TetO2 в промотор, управляющий экспрессией TetR, он создает негативный отзыв, что обеспечивает однородную экспрессию (низкий уровень шума) и линейную реакцию на дозу для аналогов тетрациклина. [10]

Элемент ответа на тетрациклин (TRE)

В наиболее часто используемых плазмиды, элемент ответа на тетрациклин состоит из 7 повторов бактериальной последовательности TetO (TCCCTATCAGTGATAGAGA) длиной 19 п.о., разделенных последовательностями спейсера (например: ACGATGTCGAGTTTAC). Именно TetO распознается и связывается частью TetR Tet-On или Tet-Off. TRE обычно размещается выше минимального промотора, который имеет очень низкую базальную экспрессию в отсутствие связанного Tet-Off (или Tet-On).

Преимущества и недостатки

Система Tet имеет преимущества перед Cre, FRT, и ER (рецептор эстрогена) системы условной экспрессии генов. В системах Cre и FRT активация или нокаут гена необратимы после завершения рекомбинации, тогда как в системах Tet и ER это обратимо. Система Tet очень жестко контролирует экспрессию, тогда как система ER несколько негерметична.[11] Однако система Tet, которая зависит от транскрипции и последующей трансляции гена-мишени, не так быстро действует, как система ER, которая стабилизирует уже экспрессированный белок-мишень при введении гормона. Кроме того, поскольку последовательность tet-o длиной 19 пар оснований в природе отсутствует в клетках млекопитающих, плейотропия считается минимальным по сравнению с гормональными методами контроля. При использовании системы Tet в культуре клеток важно убедиться, что каждая партия фетальная бычья сыворотка проверяется, чтобы подтвердить, что загрязняющие тетрациклины отсутствуют или слишком низкие, чтобы мешать индуцибельности.

Механизм действия антибактериального эффекта тетрациклинов основан на нарушении трансляции белков в бактериях, тем самым нарушая способность микробов расти и восстанавливаться; однако трансляция белков также нарушается в эукариотических митохондрии приводящие к эффектам, которые могут путать результаты экспериментов.[12][13]

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ Госсен М., Фрейндлиб С., Бендер Г., Мюллер Г., Хиллен В., Бухард Х. (июнь 1995 г.). «Активация транскрипции тетрациклинами в клетках млекопитающих». Наука. 268 (5218): 1766–9. Bibcode:1995Научный ... 268.1766G. Дои:10.1126 / science.7792603. PMID  7792603.
  2. ^ Орт П., Шнаппингер Д., Хиллен В., Сенгер В., Хинрихс В. (2000). «Структурные основы регуляции генов с помощью тетрациклин-индуцибельной системы репрессор-оператор Tet» (PDF). Структурная и молекулярная биология природы. 7 (3): 215–219. Дои:10.1038/73324. PMID  10700280. S2CID  19973826.
  3. ^ Tet-On и Tet-Off являются зарегистрированными товарными знаками Clontech Laboratories, Inc. в США.
  4. ^ Gossen M, Bujard H (июнь 1992 г.). «Жесткий контроль экспрессии генов в клетках млекопитающих с помощью промоторов, чувствительных к тетрациклину». Proc. Natl. Акад. Sci. СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ. 89 (12): 5547–51. Bibcode:1992PNAS ... 89.5547G. Дои:10.1073 / пнас.89.12.5547. ЧВК  49329. PMID  1319065.
  5. ^ Аллен Н.Д., Плагж А., Келси Г. (2000). «Направленный мутагенез в эмбриональных стволовых клетках». В Jackson IJ, Abbott CM (ред.). Генетика и трансгеники мышей: практический подход. Издательство Оксфордского университета. С. 259–263. ISBN  978-0-19-963708-9.
  6. ^ Урлингер С., Барон У., Тельманн М., Хасан М.Т., Бухард Х., Хиллен В. (июль 2000 г.). «Изучение пространства последовательностей для тетрациклин-зависимых активаторов транскрипции: новые мутации дают расширенный диапазон и чувствительность». Proc. Natl. Акад. Sci. СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ. 97 (14): 7963–8. Bibcode:2000PNAS ... 97.7963U. Дои:10.1073 / pnas.130192197. ЧВК  16653. PMID  10859354.
  7. ^ Дас А. Т., Тененбаум Л., Беркхут Б. (июнь 2016 г.). «Системы Tet-On для экспрессии гена, индуцируемого доксициклином». Современная генная терапия. 16 (3): 156–67. Дои:10.2174/1566523216666160524144041. ЧВК  5070417. PMID  27216914.
  8. ^ Чжоу X, Винк М., Клавер Б., Беркхут Б., Дас А. Т. (октябрь 2006 г.). «Оптимизация системы Tet-On для регулируемой экспрессии генов посредством вирусной эволюции». Джин Тер. 13 (19): 1382–90. Дои:10.1038 / sj.gt.3302780. PMID  16724096.
  9. ^ «Система T-REx». ThermoFisher Scientific.
  10. ^ Невожай Д., Адамс Р.М., Мерфи К.Ф., Йосич К., Балажи Г. (31 марта 2009 г.). «Отрицательная ауторегуляция линеаризует реакцию на дозу и подавляет гетерогенность экспрессии генов». Proc. Natl. Акад. Sci. СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ. 106 (13): 5123–8. Bibcode:2009ПНАС..106.5123Н. Дои:10.1073 / pnas.0809901106. ЧВК  2654390. PMID  19279212.
  11. ^ Sohal DS, Nghiem M, Crackower MA, Witt SA, Kimball TR, Tymitz KM, Penninger JM, Molkentin JD (июль 2001 г.). «Временно регулируемые и тканеспецифичные генные манипуляции во взрослом и эмбриональном сердце с использованием индуцируемого тамоксифеном белка Cre». Circ. Res. 89 (1): 20–25. Дои:10.1161 / ч1301.092687. PMID  11440973.
  12. ^ Moullan N, Mouchiroud L, Wang X, Ryu D, Williams EG, Mottis A, Jovaisaite V, Frochaux MV, Quiros PM, Deplancke B, Houtkooper RH, Auwerx J (март 2015 г.). «Тетрациклины нарушают функцию митохондрий в моделях эукариот: призыв к осторожности в биомедицинских исследованиях». Сотовый представитель. 10 (10): 1681–1691. Дои:10.1016 / j.celrep.2015.02.034. ЧВК  4565776. PMID  25772356.
  13. ^ Чатциспиру И.А., Хельд Н.М., Мучироуд Л., Ауверкс Дж., Хауткупер Р.Х. (ноябрь 2015 г.). «Тетрациклиновые антибиотики нарушают функцию митохондрий, и их экспериментальное использование затрудняет исследования». Рак Res. 75 (21): 4446–9. Дои:10.1158 / 0008-5472.CAN-15-1626. ЧВК  4631686. PMID  26475870.

внешняя ссылка