Платформа экспрессии дрожжей - Yeast expression platform

А платформа экспрессии дрожжей это напряжение дрожжи используется для производства большого количества белки, сахара или другие соединения для исследований или промышленного использования. Хотя дрожжи часто более ресурсозатратны в обслуживании, чем бактерии, некоторые продукты могут производиться только эукариотические клетки как дрожжи, что требует использования платформы для экспрессии дрожжей. Дрожжи различаются по продуктивности и способности к выделять, обрабатывать и модифицировать белки. Таким образом, разные типы дрожжей (то есть разные платформы экспрессии) лучше подходят для различных исследовательских и промышленных приложений.

Продукты

С наступлением генная инженерия, разработан ряд микроорганизмов для производства биопрепаратов. Эти продукты используются в медицине и промышленности для создания таких фармацевтических препаратов, как гепатит Б вакцина или инсулин. Общие платформы для разработки лекарств и других продуктов включают бактерии Кишечная палочка и несколько клеток дрожжей и млекопитающих (включая, в частности, Клетки яичников китайского хомячка ). В общем, микроорганизм, используемый в качестве платформы для экспрессии, должен соответствовать нескольким критериям: он должен быть способен быстро расти в больших контейнерах, производить белки эффективным способом (то есть с минимальными затратами ресурсов), быть безопасным и, в случае фармацевтических препаратов, он должен производить и модифицировать продукты, чтобы они были максимально готовы к употреблению человеком.

Используемые штаммы

Дрожжи являются обычными хозяевами для производства белков из рекомбинантная ДНК. Они предлагают относительно простую генетическую манипуляцию и быстрый рост клеток с высокой плотностью на недорогих средах. Так как эукариоты, они способны выполнять модификации белков, такие как гликозилирование которые распространены в эукариотических клетках, но относительно редко у бактерий. Благодаря этому дрожжи могут производить сложные белки, которые идентичны или очень похожи на нативные продукты растений или млекопитающих. Первая платформа для экспрессии дрожжей была основана на пекарских дрожжах. Saccharomyces cerevisiae. Однако с тех пор были изучены различные платформы экспрессии дрожжей, которые широко используются для различных приложений, исходя из их различных характеристик и возможностей. Например, некоторые из них растут на широком диапазоне источников углерода и не ограничиваются глюкоза, как и в случае с пекарскими дрожжами. Некоторые из них также применяются в генной инженерии и для производства чужеродных белков.

Arxula adeninivorans

Arxula adeninivorans (также называется Blastobotrys adeninivorans) представляет собой диморфные дрожжи, то есть растет как подающий надежды дрожжи до температуры 42 ° C, но как нитевидный образуются при более высоких температурах. A. adeninivorans имеет необычные биохимические характеристики. Он может расти на широком спектре субстратов и может ассимилировать нитраты. Штаммы A. adeninivorans были разработаны, которые могут производить натуральный пластик, и участвовали в разработке биосенсора для эстрогены в образцах окружающей среды.

Candida boidinii

Candida boidinii дрожжи, известные своей способностью расти на метаноле (так называемый метилотрофизм). Как и другие метилотрофные виды, такие как Hansenula polymorpha и Pichia pastoris, он используется как платформа для производства чужеродных белков. Урожайность в мультиграмм Сообщалось о диапазоне секретируемого чужеродного белка. Вычислительный метод IPRO недавно предсказал мутации, которые экспериментально переключали кофакторную специфичность ксилозоредуктазы Candida boidinii с НАДФН на НАДН.^[1]

Огатаеа полиморфная

Огатаеа полиморфная (синонимы Hansenula polymorpha или Pichia angusta) - это еще один метилотрофные дрожжи (см. Candida boidinii ). Он может расти на широком спектре других субстратов; он термоустойчив и может ассимилировать нитраты (см. также Kluyveromyces lactis ). Он применялся для производства вакцин против гепатита В, инсулина и интерферона альфа-2а для лечения гепатита С, а также для ряда технических ферментов.

Kluyveromyces lactis

Kluyveromyces lactis это дрожжи, которые регулярно используются для производства кефир. Он может расти на нескольких сахарах, особенно на лактоза который присутствует в молоке и сыворотке. Среди прочего, он успешно применялся для производства химозин (фермент, который обычно присутствует в желудке телят) для производства сыра. Производство происходит в ферментерах объемом 40 000 л.

Pichia pastoris

Pichia pastoris метилотрофные дрожжи (см. Candida boidinii и Hansenula polymorpha). Он обеспечивает эффективную платформу для производства чужеродных белков. Элементы платформы доступны в виде набора и используются во всем мире для производства белков. Были созданы штаммы, способные продуцировать сложный человеческий N-гликан (дрожжевые гликаны похожи, но не идентичны тем, которые обнаруживаются у людей.

Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae традиционные пекарские дрожжи, широко используемые в пивоварении и выпечке. Часто для этого одного вида используется собирательный термин «дрожжи». В качестве платформы экспрессии он успешно применяется для производства технических ферментов и таких фармацевтических препаратов, как инсулин и вакцины против гепатита B.

Yarrowia lipolytica

Yarrowia lipolytica диморфные дрожжи (см. Arxula adeninivorans), которые могут расти на широком спектре субстратов. Таким образом, он имеет высокий потенциал для промышленного применения, но коммерчески доступных рекомбинантных продуктов пока нет.

Использовать

Различные платформы экспрессии дрожжей различаются по нескольким характеристикам, включая их продуктивность и в отношении их способности секретировать, обрабатывать и модифицировать белки в конкретных примерах. Однако использование всех платформ выражения имеет некоторые общие черты.

Рис. 1. Устройство и функционирование векторной системы CoMed. Базовый вектор CoMed содержит все Кишечная палочка элементы для распространения в Кишечная палочка система и MCS (система множественного клонирования) для интеграции модулей ARS, рДНК, маркеров селекции и кассет экспрессии. Для этого фрагменты ARS фланкируются МешокII и BcuI сайты рестрикции, участки рДНК по Bcuя и Эко47III сайтов рестрикции, маркеры селекции по Эко47III и SalI сайтов рестрикции и промоторных элементов Саля и АпаЯ ограничиваю сайты.

Чтобы произвести желаемый продукт, подходящие штаммы дрожжей преобразованный с вектор который содержит все необходимые генетические элементы для производства интересующего биологического продукта. Векторы также должны содержать маркер выбора, который требуется для выбора дрожжей, которые успешно поглотили вектор, из тех, которые не приняли его. Векторы также содержат определенные элементы ДНК, позволяющие дрожжам включать чужеродные ДНК в хромосому дрожжей и воспроизвести его. Что наиболее важно, векторы содержат сегмент, ответственный за продукцию желаемого соединения, называемый кассета экспрессии. Кассета содержит последовательность регулирующих элементов, которые контролируют, сколько и при каких обстоятельствах в конечном итоге производится определенный продукт. Далее следует ген самого биологического продукта. Кассета экспрессии заканчивается терминаторной последовательностью, которая останавливает транскрипция экспрессированного гена.

использованная литература

^ Хури, Джорджия; Fazelinia, H; Чин, JW; Pantazes, RJ; Чирино, ПК; Маранас, CD (октябрь 2009 г.). «Расчетный дизайн ксилозоредуктазы Candida boidinii для измененной специфичности кофактора». Белковая наука. 18 (10): 2125–38. Дои:10.1002 / pro.227. ЧВК 2786976. PMID 19693930.

Gellissen G (ed) (2005) Производство рекомбинантных белков - новых микробных и эукариотических систем экспрессии. Wiley-VCH, Weinheim.ISBN 3-527-31036-3

[1] Хури, Джорджия; Fazelinia, H; Чин, JW; Pantazes, RJ; Чирино, ПК; Маранас, CD (октябрь 2009 г.). «Расчетный дизайн ксилозоредуктазы Candida boidinii для измененной специфичности кофактора». Белковая наука. 18 (10): 2125–38. Дои:10.1002 / pro.227. ЧВК 2786976. PMID 19693930.

[1]