Pichia pastoris - Pichia pastoris

Pichia pastoris
Научная классификация
Королевство:
Грибы
Тип:
Аскомикота
Учебный класс:
Сахаромицеты
Заказ:
Saccharomycetales
Семья:
Saccharomycetaceae
Род:
Пичиа / Komagataella
Разновидность:
пастор
Биномиальное имя
Pichia pastoris
Ячейки Pichia pastoris

Pichia pastoris это разновидность метилотрофный дрожжи. Он был найден в 1960-х годах, с его особенностью использования метанол, как источник углерода и энергии.[1] После долгих лет учебы P. pastoris широко использовался в Биохимический исследования и Биотехнологическая промышленность. С большим потенциалом стать система экспрессии за производство белка, а также будучи модельный организм для генетического исследования, P. pastoris стало важным для биологических исследований и биотехнологических приложений. В последнее десятилетие некоторые отчеты переназначены P. pastoris к роду Komagataella с филогенетический анализ, к секвенирование генома из P. pastoris. Вид был разделен на К. phaffii, К. пасторис, и К. псевдопасторис.[2]

P. pastoris в природе

Естественная среда обитания

Естественно, P. pastoris живут на деревьях, таких как каштаны. Они гетеротрофы и могут использовать несколько источников углерода для жизни, например глюкоза, глицерин и метанол.[3] Однако они не могут использовать лактоза.

Размножение

P. pastoris может пройти как бесполое размножение и сексуальный воспроизведение подающий надежды и аскоспора.[4] В этом случае два типа ячеек P. pastoris существовать: гаплоид и диплоид клетки. В бесполом жизненный цикл, гаплоидные клетки подвергаются митозу для размножения. В половом жизненном цикле диплоидные клетки подвергаются спороношение и мейоз.[5] Скорость роста его колоний может варьироваться в широком диапазоне, от почти до 0 до времени удвоения в один час, что подходит для промышленных процессов.[6]

P. pastoris как модельный организм

В последние несколько лет, P. pastoris был исследован и идентифицирован как хороший модельный организм с рядом преимуществ. Прежде всего, P. patoris можно легко выращивать и использовать в лаборатории. Как и другие широко используемые модели дрожжей, он имеет относительно короткий срок службы и быстрое время регенерации. Более того, были разработаны недорогие питательные среды, так что P. patoris может быстро расти на них с высокой плотностью клеток.[7]Секвенирование всего генома для P. patoris было выполнено. В P. pastoris Геном GS115 был секвенирован Институтом биотехнологии Фландрии и Гентским университетом и опубликован в Природа Биотехнологии.[8] Последовательность генома и аннотацию генов можно просмотреть через ORCAE система. Полные геномные данные позволяют ученым идентифицировать гомологичные белки и эволюционные отношения между другими видами дрожжей и P. pastoris. Более того, P. pastoris одиноки эукариотический клетки, что означает, что исследователи могут исследовать белки внутри P. pastoris. Затем можно провести гомологичное сравнение с другими более сложными видами эукариот, чтобы получить их функции и происхождение.[9]

Еще одно преимущество P. pastoris его сходство с хорошо изученной моделью дрожжей - Saccharomyces cerevisiae. Как модельный организм по биологии, С. cerevisiae были хорошо изучены на протяжении десятилетий и использовались исследователями для различных целей на протяжении всей истории. Два рода дрожжей; Пичиа и Сахаромицеты, имеют аналогичные условия роста и допуски; таким образом, культура P. pastoris могут быть приняты лабораториями без многих модификаций.[10] Более того, в отличие от С. cerevisiae, P. pastoris обладает способностью функционально обрабатывать белки с большой молекулярной массой, что полезно для трансляционного хозяина.[11]Учитывая все преимущества, P. pastoris могут быть успешно использованы как в качестве генетической, так и в качестве экспериментальной модели организма.

P. pastoris как генетическая модель организма

Как генетический модельный организм, P. pastoris может использоваться для генетического анализа и крупномасштабных генетическое скрещивание, с полными данными о геноме и его способностью выполнять сложную генетическую обработку эукариот в относительно небольшом геноме. Функциональные гены пероксисома сборки были исследованы путем сравнения штаммов дикого типа и мутантных штаммов P. pastoris.[12]

P. pastoris как экспериментальный модельный организм

Как экспериментальный модельный организм, P. pastoris в основном использовался как хост-система для трансформации. Из-за его способности рекомбинировать с чужеродной ДНК и обрабатывать большие белки, было проведено много исследований для изучения возможности производства новых белков и функции искусственно созданных белков с использованием P. pastoris как хозяин трансформации.[13] В последнее десятилетие, P. pastoris был разработан, чтобы построить система экспрессии платформы, что является типичным приложением для стандартной экспериментальной модели организма, как описано ниже.

P. pastoris как платформа системы выражения

P. pastoris часто используется как система экспрессии для производства гетерологичный белки. Несколько свойств делают P. pastoris подходит для этой задачи. В настоящее время несколько штаммов P. pastoris используются в биотехнических целях, причем между ними существенные различия в росте и производстве белка.[14] Некоторые распространенные варианты обладают мутацией в Ген HIS4, что приводит к выбору ячеек, которые преобразованный успешно с векторы экспрессии. Технология интеграции векторов в P. pastoris геном похож на Saccharomyces cerevisiae.[15]

Преимущество

1:P. pastoris способен расти на простой недорогой среде с высокой скоростью роста. P. pastoris может расти в любом встряхнуть колбы или ферментер, что делает его пригодным как для мелкосерийного, так и для крупного производства.[16]

2:P. pastoris имеет два алкогольоксидаза гены Aox1 и Aox2, которые включают сильно индуцируемый промоутеры.[17] Эти два гена позволяют Пичиа использовать метанол в качестве углерод и источник энергии. Промоторы AOX индуцируются метанол и подавляется глюкоза. Обычно ген желаемого белка вводится под контролем Aox1 промотор, что означает, что продукцию белка можно индуцировать добавлением метанола в среду. После нескольких исследований ученые обнаружили, что промотор произошел от AOX1 ген в P. pastoris чрезвычайно подходит для контроля экспрессии чужеродных генов, которые были преобразованы в P. pastoris геном, продуцирующий гетерологичные белки.[18]

3: с ключом черта, P. pastoris могут расти с чрезвычайно высокой плотностью клеток в культуре. Эта функция совместима с экспрессией гетерологичного белка, что дает более высокий выход продукции.[19]

4: Технология, необходимая для генетической обработки P. pastoris похож на Saccharomyces cerevisiae, который является одним из наиболее хорошо изученных модельных организмов дрожжей. В результате протокол эксперимента и материалы легко построить для P. pastoris.[20]

Недостаток

Поскольку некоторые белки требуют шаперонин для правильного складывания, Пичиа не может производить ряд белков, так как P. pastoris не содержит соответствующих шаперонов. Технологии введения генов шаперонинов млекопитающих в геном дрожжей и сверхэкспрессии существующих шаперонинов все еще нуждаются в улучшении.[21][22]

Сравнение с другими системами экспрессии

В стандартной молекулярная биология исследование, бактерия кишечная палочка является наиболее часто используемым организмом для системы экспрессии, чтобы производить гетерологичные белки, благодаря его особенностям быстрого роста, высокой продуктивности белка, а также нетребовательным условиям выращивания. Производство белка в Кишечная палочка обычно быстрее, чем в P. pastoris, по причинам: Компетентный Кишечная палочка клетки можно хранить замороженными и размораживать перед использованием, тогда как Пичиа клетки должны быть получены непосредственно перед использованием. выход экспрессии у Pichia варьируется в зависимости от клоны, поэтому необходимо проверить большое количество клонов на продукцию белка, чтобы найти лучшего производителя. Самое большое преимущество Пичиа над Кишечная палочка в том, что Пичиа способен формировать дисульфид облигации и гликозилирование в белках, но Кишечная палочка не можешь.[23] Кишечная палочка может образовывать неправильно свернутый белок, когда дисульфиды включены в конечный продукт, что приводит к неактивным или нерастворимым формам белков.[24]

Хорошо изученный Saccharomyces cerevisiae также используется как экспрессионная система с аналогичными преимуществами перед Кишечная палочка в качестве Пичиа. тем не мение Пичиа имеет два основных преимущества перед С. cerevisiae в лабораторных и промышленных условиях:

  1. Пичиа, как упоминалось выше, является метилотроф, что означает, что он может расти с помощью простого метанола как единственного источника энергии - Пичиа может быстро расти в клеточная суспензия с достаточно крепким раствором метанола, который убьет большинство других микроорганизмов. В этом случае установка и обслуживание системы экспрессии обходятся недорого.
  2. Пичиа может вырасти до очень высокой плотности клеток. В идеальных условиях он может размножаться до такой степени, что клеточная суспензия практически превращается в пасту. Поскольку выход белка из системы экспрессии в микробе примерно равен продукту белков, продуцируемых на клетку, что делает Пичиа очень полезен при попытке произвести большое количество белка без дорогостоящего оборудования.[23]

По сравнению с другими системами экспрессии, такими как S2-клетки из Drosophila melanogaster и Клетки яичников китайского хомячка, Пичиа обычно дает гораздо лучшие урожаи. Сотовые линии от многоклеточных организмов требуют сложных и дорогих типов сред, в том числе аминокислоты, витамины, а также другие факторы роста. Эти типы сред значительно увеличивают стоимость производства гетерологичных белков. Кроме того, поскольку Пичиа может расти в средах, содержащих только один источник углерода и один азот источник, который подходит для изотопных этикеток, например белок ЯМР.[23]

Промышленное применение

P. pastoris были использованы в нескольких видах биотехнологической промышленности, таких как фармацевтическая индустрия. Все приложения основаны на его способности экспрессировать белки.

Биотерапевтическое производство

В последние несколько лет, Pichia pastoris был использован для производства более 500 наименований биотерапия, Такие как IFNγ. Вначале одним из недостатков этой системы экспрессии белков является чрезмернаягликозилирование с высокой плотностью манноза структура, которая является потенциальной причиной иммуногенность.[25][26] В 2006 году исследовательской группе удалось создать новый штамм под названием YSH597. Этот штамм может выражать эритропоэтин в своей нормальной форме гликозилирования путем обмена ферментов, ответственных за гликозилирование грибкового типа, с гомологами млекопитающих. Таким образом, измененный паттерн гликозилирования позволяет белку быть полностью функциональным.[27]

Производство ферментов для пищевой промышленности

В пищевой промышленности, такой как пивоварня и пекарня,Pichia pastoris используется для производства различных ферментов, например технологические добавки и пищевые добавки, с множеством функций. Например, некоторые ферменты, производимые генетически модифицированными Pichia pastoris может сохранить хлеб мягким. Между тем, в пиве можно использовать ферменты для снижения концентрации алкоголя.[28]

Рекомендации

  1. ^ Коичи Огата, Хидео Нисикава и Масахиро Осуги (1969). «Дрожжи, способные использовать метанол». Сельскохозяйственная и биологическая химия. 33 (10): 1519–1520. Дои:10.1080/00021369.1969.10859497.
  2. ^ Де Шуттер, К., Лин, Ю., Тильс, П. (2009). «Последовательность генома хозяина-продуцента рекомбинантного белка Pichia pastoris». Природа Биотехнологии. 27 (6): 561–566. Дои:10.1038 / nbt.1544. PMID  19465926.CS1 maint: несколько имен: список авторов (связь)
  3. ^ Ребнеггер, К., Вос, Т., Граф, А. Б., Валли, М., Пронк, Дж. Т., Даран-Лапуджаде, П., и Маттанович, Д. (2016). «Pichia pastoris демонстрирует высокую жизнеспособность и низкую потребность в энергии при почти нулевом удельном росте». Прикладная и экологическая микробиология. 82 (15): 4570–4583. Дои:10.1128 / AEM.00638-16. ЧВК  4984280. PMID  27208115.CS1 maint: несколько имен: список авторов (связь)
  4. ^ Курцман (1998). «42 - Пичиа Э. К. Хансен исправляет. Курцман». Дрожжи: таксономическое исследование. 1: 273–352. Дои:10.1016 / B978-044481312-1 / 50046-0. ISBN  9780444813121.
  5. ^ Зёргё Э, Хвялковска К., Гювсланд А.Б., Гарре Э., Саннерхаген П., Лити Дж., Бломберг А., Омхольт С.В., Уоррингер Дж. (2013). «Древние эволюционные компромиссы между состояниями дрожжевой плоидности». PLOS Genetics. 9 (3): e1003388. Дои:10.1371 / journal.pgen.1003388. ЧВК  3605057. PMID  23555297.CS1 maint: несколько имен: список авторов (связь)
  6. ^ Кастилан, Р., Бос, А., Шпигель, Х. (2017). «Улучшение процесса ферментации для производства двух кандидатов вакцины против малярии на основе PfAMA1-DiCo в Pichia pastoris». Природа. 1 (1): 7. Bibcode:2017НатСР ... 711991K. Дои:10.1038 / s41598-017-11819-4. ЧВК  5607246. PMID  28931852.CS1 maint: несколько имен: список авторов (связь)
  7. ^ М. М. Гуарна Г. Дж. Лесницки Б. М. Там Дж. Робинсон К. З. Радзимински Д. Хазенвинкль А. Борастон Э. Джервис Р. Т. А. Макгилливрей Р. Ф. Б. Тернер Д. Г. Килберн (1997). «Оперативный мониторинг и контроль концентрации метанола в культурах Pichia pastoris во встряхиваемых колбах». Биотехнологии и биоинженерия. 56 (3): 279–286. Дои:10.1002 / (SICI) 1097-0290 (19971105) 56: 3 <279 :: AID-BIT5> 3.0.CO; 2-G. PMID  18636643.
  8. ^ Де Шуттер К., Лин Ю.С., Тильс П., Ван Хекке А., Глинка С., Вебер-Леманн Дж., Рузе П., Ван де Пер Й., Каллеварт Н. (июнь 2009 г.). «Последовательность генома хозяина-продуцента рекомбинантного белка Pichia pastoris». Природа Биотехнологии. 27 (6): 561–6. Дои:10.1038 / nbt.1544. PMID  19465926.
  9. ^ Бриджит Гассер, Роланд Приельхофер, Ганс Маркс, Майкл Маурер, Юстина Нокон, Маттиас Штайгер, Верена Пуксбаум, Майкл Зауэр и Дитард Маттанович (2013). «Pichia pastoris: хозяин для производства белка и модельный организм для биомедицинских исследований». Будущая микробиология. 8 (2): 191–208. Дои:10.2217 / fmb.12.133. PMID  23374125.CS1 maint: несколько имен: список авторов (связь)
  10. ^ Тран, А., Нгуен, Т., Нгуен, К. (2017). «Pichia pastoris против Saccharomyces cerevisiae: тематическое исследование рекомбинантного производства человеческого фактора, стимулирующего колонии гранулоцитов-макрофагов». BMC Res Примечания. 10 (1): 148. Дои:10.1186 / s13104-017-2471-6. ЧВК  5379694. PMID  28376863.CS1 maint: несколько имен: список авторов (связь)
  11. ^ Heidebrecht, Aniela и Thomas Scheibel (2013). «Рекомбинантное производство белков паучьего шелка». Успехи прикладной микробиологии. 82: 115–153. Дои:10.1016 / B978-0-12-407679-2.00004-1. ISBN  9780124076792. PMID  23415154.CS1 maint: несколько имен: список авторов (связь)
  12. ^ Гулд, С. Дж., Макколлум, Д., Спонг, А. П., Хейман, Дж. А., и Субрамани, С. (1992). «Разработка дрожжей Pichia pastoris в качестве модельного организма для генетического и молекулярного анализа сборки пероксисом». Дрожжи: таксономическое исследование. 8 (8): 613–628. Дои:10.1002 / год.320080805. PMID  1441741.CS1 maint: несколько имен: список авторов (связь)
  13. ^ Крегг, Дж. М., Барринджер, К. Дж., Хесслер, А. Ю., и Мэдден, К. Р. (1985). «Pichia pastoris как принимающая система для преобразований». Молекулярная и клеточная биология. 5 (12): 3376–3385. Дои:10.1128 / MCB.5.12.3376. ЧВК  369166. PMID  3915774.CS1 maint: несколько имен: список авторов (связь)
  14. ^ Брэди, Дж. Р. (2020). «Сравнительный анализ генома вариантов Pichia pastoris позволяет выбрать оптимальный базовый штамм». Биотехнологии и биоинженерия. 117 (2): 543–555. Дои:10.1002 / бит. 27209. ЧВК  7003935. PMID  31654411.
  15. ^ Хиггинс Д. Р. и Крегг Дж. М. (1998). «Введение в Pichia pastoris». Протоколы Пичиа. 103: 1–15. Дои:10.1385/0-89603-421-6:1. ISBN  0-89603-421-6. PMID  9680629.CS1 maint: несколько имен: список авторов (связь)
  16. ^ Вэньхуэй Чжан Марк А. Бевинс Брэдли А. Планц Леонард А. Смит Майкл М. Мигер. (2000). «Моделирование роста Pichia pastoris на метаноле и оптимизация производства рекомбинантного белка, фрагмента тяжелой цепи C нейротоксина ботулина серотипа A». Биотехнологии и биоинженерия. 70 (1): 1–8. Дои:10.1002 / 1097-0290 (20001005) 70: 1 <1 :: AID-BIT1> 3.0.CO; 2-Y. PMID  10940857.
  17. ^ Дэйли Р., Хирн MT (2005). «Экспрессия гетерологичных белков в Pichia pastoris: полезный экспериментальный инструмент в разработке и производстве белков». Журнал молекулярного распознавания. 18 (2): 119–38. Дои:10.1002 / jmr.687. PMID  15565717.
  18. ^ Романос, Майк. (1995). «Достижения в использовании Pichia pastoris для экспрессии генов высокого уровня». Текущее мнение в области биотехнологии. 6 (5): 527–533. Дои:10.1016/0958-1669(95)80087-5.
  19. ^ Чжоу, X., Yu, Y., Tao, J., & Yu, L. (2014). «Производство LYZL6, нового лизоцима c-типа человека, в рекомбинантном Pichia pastoris с использованием периодической ферментации с подпиткой с высокой плотностью клеток». Журнал биологии и биоинженерии . 118 (4): 420–425. Дои:10.1016 / j.jbiosc.2014.03.009. PMID  24745549.CS1 maint: несколько имен: список авторов (связь)
  20. ^ Мортон, К. Л., и Поттер, П. М. (2000). «Сравнение клеток Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Spodoptera frugiperda и COS7 для экспрессии рекомбинантных генов». Молекулярная биотехнология. 16 (3): 193–202. Дои:10.1385 / МБ: 16: 3: 193. PMID  11252804. S2CID  22792748.CS1 maint: несколько имен: список авторов (связь)
  21. ^ Bankefa, OE; Ван, М; Чжу, Т; Ли, Y (июль 2018). «Гомологи Hac1p от высших эукариот могут улучшить секрецию гетерологичных белков в дрожжах Pichia pastoris». Письма о биотехнологии. 40 (7): 1149–1156. Дои:10.1007 / s10529-018-2571-у. PMID  29785668. S2CID  29155989.
  22. ^ Юй Сяо-Вэй; Вс, Вэй-Хун; Ван, Ин-Чжэн; Сюй, Ян (24 ноября 2017 г.). «Идентификация новых факторов, повышающих продукцию рекомбинантного белка у многокопийных Komagataella phaffii на основе транскриптомного анализа эффектов сверхэкспрессии». Научные отчеты. 7 (1): 16249. Bibcode:2017НатСР ... 716249Y. Дои:10.1038 / с41598-017-16577-х. ЧВК  5701153. PMID  29176680.
  23. ^ а б c Крегг Дж. М., Толсторуков И., Кусари А., Сунга Дж., Мэдден К., Чаппелл Т. (2009). Экспрессия в дрожжах Pichia pastoris. Meth. Энзимол. Методы в энзимологии. 463. С. 169–89. Дои:10.1016 / S0076-6879 (09) 63013-5. ISBN  978-0-12-374536-1. PMID  19892173.
  24. ^ Брондык WH (2009). Выбор подходящего метода экспрессии рекомбинантного белка. Meth. Энзимол. Методы в энзимологии. 463. С. 131–47. Дои:10.1016 / S0076-6879 (09) 63011-1. ISBN  978-0-12-374536-1. PMID  19892171.
  25. ^ Разаги А., Тан Э, Луа Л. Х., Оуэнс Л., Картикеян О. П., Хейманн К. (январь 2017 г.). «Является ли Pichia pastor реальной платформой для промышленного производства рекомбинантного гамма-интерферона человека?». Биологические препараты. 45: 52–60. Дои:10.1016 / j.biologicals.2016.09.015. PMID  27810255.
  26. ^ Али Разаги; Роджер Хуэрлиманн; Ли Оуэнс; Кирстен Хейманн (2015). «Повышенная экспрессия и секреция рекомбинантного hIFNγ за счет селективного давления, вызванного аминокислотным голоданием, на соседний ген HIS4 у Pichia pastoris». Европейский фармацевтический журнал. 62 (2): 43–50. Дои:10.1515 / afpuc-2015-0031.
  27. ^ Гамильтон С.Р., Дэвидсон Р.К., Сетураман Н., Нетт Дж. Х., Цзян Й., Риос С., Бобрович П., Стадхейм Т. А., Ли Х., Чой Б. К., Хопкинс Д., Вишневски Х., Розер Дж., Митчелл Т., Стробридж Р. Р., Хупс Дж., Уайлд С. , Гернгросс Т.У. (сентябрь 2006 г.). «Гуманизация дрожжей для производства сложных концевых сиалилированных гликопротеинов». Наука. 313 (5792): 1441–3. Bibcode:2006Научный ... 313.1441H. Дои:10.1126 / наука.1130256. PMID  16960007. S2CID  43334198.
  28. ^ Спохнер, С.С., Мюллер, Х., Квитманн, Х., и Чермак, П. (2015). «Экспрессия ферментов для использования в пищевой и кормовой промышленности с Pichia pastoris». Журнал биотехнологии. 202: 420–425. Дои:10.1016 / j.jbiotec.2015.01.027. PMID  25687104.CS1 maint: несколько имен: список авторов (связь)