Анализ разветвленной ДНК - Branched DNA assay

В биологии анализ разветвленной ДНК представляет собой анализ усиления сигнала (в отличие от анализа целевой амплификации), который используется для обнаружения нуклеиновая кислота молекулы.[1]

Метод

Анализ разветвленной ДНК начинается с чашки или другой твердой подложки (например, пластиковой индикаторной полоски). Блюдо усыпано небольшими одноцепочечными молекулами (или цепочками) ДНК, которые «торчат» в воздух. Они известны как молекулы ДНК зонда захвата. Затем добавляется молекула-удлинитель ДНК. У каждого расширителя есть два домена; тот гибридизирует к захватывающей молекуле ДНК и той, которая «зависает» в воздухе. У удлинителя двоякое назначение. Во-первых, он создает более доступную площадь поверхности для связывания целевых молекул ДНК, а во-вторых, позволяет легко адаптировать анализ для обнаружения различных целевых молекул ДНК.

После того, как молекулы захвата и удлинителя находятся на месте и гибридизуются, можно добавлять образец. Целевые молекулы в образце будут связываться с молекулой-наполнителем. Это приводит к тому, что основание присыпается зондами захвата, которые гибридизируются с зондами-удлинителями, которые, в свою очередь, гибридизуются с молекулами-мишенями.

В этот момент происходит усиление сигнала. Добавляется молекула ДНК-удлинителя метки, которая имеет два домена (аналогично первому удлинителю). Удлинитель метки гибридизуется с мишенью и с предварительно амплифицированной молекулой. Молекула предусилителя имеет два домена. Во-первых, он связывается с удлинителем метки, а во-вторых, он связывается с молекулой усилителя. Примером молекулы усилителя является олигонуклеотид цепь, связанная с ферментом щелочная фосфатаза.

Схематично процесс можно представить как
База → Зонд захвата → Удлинитель → Цель → расширитель этикеток → предварительный усилитель → усилитель

Использование и преимущества

В проба может использоваться для обнаружения и количественной оценки многих типов РНК или ДНК-мишеней. В пробе разветвленная ДНК смешивается с исследуемым образцом. Обнаружение осуществляется нерадиоактивным методом и не требует предварительной амплификации нуклеиновой кислоты для обнаружения. Анализ полностью основан на гибридизации. Ферменты используются для обозначения степени гибридизации, но не используются для манипулирования нуклеиновыми кислотами. Таким образом, небольшие количества нуклеиновой кислоты могут быть обнаружены и количественно определены без обратная транскрипция step (в случае РНК) и / или ПЦР. Анализ может быть проведен как высокопроизводительный анализ, в отличие от количественного. Нозерн-блоттинг или анализ защиты от РНКазы, которые являются трудоемкими и, следовательно, трудными для выполнения на большом количестве образцов. Другой важный высокопроизводительный метод, используемый для количественной оценки конкретных молекул РНК, - это количественная ПЦР, после обратной транскрипции РНК к кДНК.

Несколько разных коротких одноцепочечных молекул ДНК (олигонуклеотиды ) используются в анализе разветвленной ДНК. Олигонуклеотид-расширитель захвата и захвата связывается с нуклеиновой кислотой-мишенью и иммобилизует ее на твердой подложке. Затем олигонуклеотид-метка и разветвленная ДНК обнаруживают иммобилизованную нуклеиновую кислоту-мишень. Иммобилизация мишени на твердой подложке облегчает обширную промывку, что снижает количество ложноположительных результатов. После связывания мишени с твердой подложкой ее можно обнаружить с помощью разветвленной ДНК, которая связана с ферментом (например, щелочной фосфатазой). Разветвленная ДНК связывается с нуклеиновой кислотой образца посредством специфической гибридизации в областях, которые не заняты захватывающими гибридами. Разветвление ДНК позволяет очень плотно декорировать ДНК ферментом, что важно для высокой чувствительности анализа.[нужна цитата ]. Фермент катализирует реакцию субстрата, излучающего свет (обнаруживаемый люминометром). Количество испускаемого света увеличивается с увеличением количества конкретной нуклеиновой кислоты, присутствующей в образце. Конструкция разветвленной ДНК и способ ее гибридизации с исследуемой нуклеиновой кислотой различаются в разных поколениях анализа bDNA.[2]Несмотря на то, что исходный материал не предварительно амплифицирован, анализы бДНК могут обнаруживать менее 100 копий РНК ВИЧ на мл крови.[2]

Смотрите также

Примечания и ссылки

  1. ^ Ариффин, Сити Нур Фатила Ахмад (2013). «Разветвленная ДНК: новый метод молекулярной диагностики в костных исследованиях». Обновления исследований в области медицинских наук (RUMeS). 1 (1): 27–29.
  2. ^ а б Collins, M. L .; Irvine, B .; Tyner, D .; Хорошо, E .; Zayati, C .; Chang, C .; Рог, Т .; Ahle, D .; Detmer, J .; Shen, L.P .; Кольберг, Дж .; Bushnell, S .; Urdea, M. S .; Хо, Д. Д. (1997). «Анализ амплификации сигнала разветвленной ДНК для количественного определения целевых нуклеиновых кислот ниже 100 молекул / мл». Исследования нуклеиновых кислот. 25 (15): 2979–2984. Дои:10.1093 / nar / 25.15.2979. ЧВК  146852. PMID  9224596.

внешняя ссылка