Эпистаз и функциональная геномика - Википедия - Epistasis and functional genomics

Эпистаз относится к генетическим взаимодействиям, в которых мутация одного гена маскирует фенотипический последствия мутации в другом локус.[1] Систематический анализ этих эпистатических взаимодействий может дать представление о структуре и функциях генетических путей. Изучение фенотипов, возникающих в результате пар мутаций, помогает понять, как функции этих генов пересекаются. Генетические взаимодействия обычно классифицируются как положительные / облегчающие или отрицательные / отягчающие. Фитнес-эпистаз (взаимодействие между не-аллельный генов) является положительным (другими словами, уменьшающимся, антагонистическим или буферным), когда мутация потери функции двух данных генов приводит к превышению фитнес прогнозируется на основе индивидуальных эффектов вредных мутаций, и он отрицательный (то есть усиливающий, синергетический или отягчающий), когда снижает приспособленность.[2] Рышард Корона и Лукас Яснос показали, что эпистатический эффект обычно бывает положительным. Saccharomyces cerevisiae. Обычно даже в случае положительных взаимодействий двойной мутант имеет меньшую приспособленность, чем одиночные мутанты.[2] Положительные взаимодействия происходят часто, когда оба гена находятся в одном и том же путь [3] И наоборот, отрицательные взаимодействия характеризуются еще более сильным дефектом, чем можно было бы ожидать в случае двух одиночных мутаций, и в самых крайних случаях (синтетическое заболевание / летальный исход) двойная мутация является летальной. Этот усугубленный фенотип возникает, когда оба гена компенсаторных путей выбит.

Высокопроизводительные методы анализа этих типов взаимодействий были полезны для расширения наших знаний о генетических взаимодействиях. Синтетические генетические массивы (SGA), диплоидный синтетический анализ летальности на микрочипах (dSLAM) и эпистатические профили мини-массивов (E-MAP) - три важных метода, которые были разработаны для систематического анализа и картирования генетических взаимодействий. Этот систематический подход к изучению эпистаза в масштабе всего генома имеет важное значение для функциональная геномика. Путем выявления отрицательных и положительных взаимодействий между неизвестным геном и набором генов в пределах известного пути эти методы могут прояснить функцию ранее не охарактеризованных генов в контексте метаболический или путь развития.

Предполагаемая функция: облегчение и усугубление мутаций

Чтобы понять, как информация об эпистатических взаимодействиях связана с генными путями, рассмотрим простой пример дифференцировки клеток вульвы в C. elegans. Клетки дифференцируются от клеток Pn до клеток Pn.p, клеток VP и клеток вульвы. Мутация лин-26[4] блокирует дифференцировку клеток Pn в клетки Pn.p. Мутанты лин-36[5] ведут себя аналогично, блокируя дифференцировку при переходе в клетки VP. В обоих случаях результирующий фенотип отмечен отсутствием вульвальных клеток, так как имеется блок на пути дифференцировки. Двойной мутант, у которого оба эти гена были нарушены, демонстрирует эквивалентный фенотип, не хуже, чем любой одиночный мутант. Нарушение восходящего потока в lin-26 маскирует фенотипический эффект мутации в lin-36. [1] в классическом примере облегчения эпистатического взаимодействия.

С другой стороны, усугубляющие мутации вызывают фенотип, который хуже совокупного эффекта каждой отдельной мутации. Этот усиленный фенотип указывает на наличие двух генов в компенсаторных путях. В случае одиночного мутанта параллельный путь способен компенсировать потерю нарушенного пути, однако в случае двойного мутанта действие этого компенсаторного пути также теряется, что приводит к наблюдаемому более драматическому фенотипу. Эту взаимосвязь было значительно легче обнаружить, чем более тонкие смягчающие фенотипы, и она была тщательно изучена на S. cerevisiae с помощью синтетический больной / смертельный (SSL) скрининг, который идентифицирует двойные мутанты со значительно сниженной скоростью роста.

Следует отметить, что эти выводы из анализа двойных мутантов, хотя и применимы ко многим путям и мутантам, не универсальны. Например, гены могут действовать в различных направлениях в противоположных направлениях, так что нокаут обоих приводит к почти нормальному фенотипу, в то время как каждый отдельный мутант серьезно поражается (в противоположных направлениях). Хорошо изученный пример встречается во время раннего развития у дрозофилы, где генные продукты из горбун и нано гены присутствуют в яйце и действуют в противоположных направлениях, направляя формирование передне-заднего паттерна. Нечто подобное часто происходит в путях передачи сигнала, где отключение негативного регулятора пути вызывает фенотип гиперактивации, тогда как отключение позитивно действующего компонента вызывает противоположный фенотип. В линейных путях с одним «выходом», когда нокаутные мутации в двух противоположно действующих генах комбинируются у одного и того же индивидуума, фенотип двойного мутанта обычно такой же, как фенотип одиночного мутанта, чей нормальный генный продукт действует ниже по течению. путь.

Методы обнаружения мутантов SSL

SGA и dSLAM

Синтетические генетические массивы (SGA) и диплоидный синтетический анализ летальности микрочипов (dSLAM) - два ключевых метода, которые использовались для идентификации синтетических смертельных мутантов больных и характеристики отрицательных эпистатических связей. Секвенирование всего генома дрожжей позволило создать библиотеку нокаут-мутантов почти для каждого гена в геноме. Эти со штрих-кодом на молекулярном уровне мутанты значительно облегчают высокопроизводительные исследования эпистаза, поскольку их можно объединять и использовать для создания необходимых двойных мутантов. Оба подхода, SGA и dSLAM, основаны на этих штаммах с нокаутом дрожжей, которые трансформируются / скрещиваются для получения гаплоидных двойных мутантов. Затем профилирование микроматрицы используется для сравнения приспособленности этих одиночных и двойных мутантов. В случае SGA исследуемые двойные мутанты являются гаплоидными и собираются после скрещивания с мутантным штаммом с последующим несколькими раундами отбора. Штаммы dSLAM как одиночных, так и двойных мутантов происходят от одного и того же диплоидного гетерозиготного штамма (обозначенного «диплоидом» в слове «dSLAM»). В случае анализа dSLAM пригодность одиночных и двойных мутантов оценивается с помощью анализа на микрочипах анализа конкуренции роста.

Эпистатические профили миниатюрных массивов (E-MAPs)

Чтобы лучше понять генетические взаимодействия, экспериментальные подходы отходят от этого двоичная классификация фенотипов как диких или синтетических летальных. Подход E-MAP особенно привлекателен из-за его способности подчеркивать как смягчающие, так и отягчающие эффекты, и эта способность отличает этот метод от других, таких как SGA и dSLAM. Более того, E-MAP не только идентифицирует оба типа взаимодействий, но также распознает градации этих взаимодействий и серьезность замаскированного фенотипа, представленного оценкой взаимодействия, применяемой к каждой паре генов.

E-MAP используют подход SGA для анализа генетических взаимодействий в высокая пропускная способность манера. Хотя этот метод был специально разработан для исследования эпистаза у S. cerevisiae, он может быть применен к другим модельные организмы также. E-MAP сопоставляет данные, полученные в результате систематического создания двойных мутантных штаммов для большой четко определенной группы генов. Каждый фенотипический ответ количественно оценивается путем визуализации размера колонии для определения скорости роста. Эта оценка пригодности сравнивается с предсказанной пригодностью для каждого отдельного мутанта, в результате чего получается оценка генетического взаимодействия.Иерархическая кластеризация Эти данные для группировки генов со сходными профилями взаимодействия позволяют идентифицировать эпистатические отношения между генами с известной функцией и без нее. Посредством сортировки данных таким образом, гены, о которых известно, что они взаимодействуют, будут объединяться вместе с генами, которые демонстрируют аналогичный паттерн взаимодействий, но функции которых еще не определены. Таким образом, данные E-MAP могут вводить гены в новые функции в пределах хорошо изученных путей. Рассмотрим, например, E-MAP, представленный Collins et al. который объединяет транскрипционные коэффициент удлинения Dst1[6] наряду с компонентами средней области комплекса Mediator, который участвует в транскрипционная регуляция.[7] Это предполагает новую роль Dst1, функционирующую совместно с Mediator.

Выбор генов, исследуемых в рамках данного E-MAP, имеет решающее значение для достижения плодотворных результатов. Особенно важно, чтобы значительная часть исследованных генов была хорошо известна в литературе. Таким образом, эти гены могут действовать как элементы управления для E-MAP, что позволяет с большей уверенностью анализировать данные не охарактеризованных генов. Кластеры, организованные по субклеточной локализации и общеклеточным процессам (например, клеточный цикл ) дали полезные результаты у S. cerevisiae. Данные из белок-белковое взаимодействие исследования также могут предоставить полезную основу для выбора групп генов для данных E-MAP. Мы ожидаем, что гены, которые проявляют физические взаимодействия, также продемонстрируют взаимодействия на генетическом уровне и, таким образом, могут служить адекватным контролем для данных E-MAP. Коллинз и др. (2007) провели сравнение оценок E-MAP и данных физического взаимодействия из крупномасштабных аффинная очистка методы (AP-MS) и их данные демонстрируют, что подход E-MAP идентифицирует белок-белковые взаимодействия со специфичностью, равной специфичности традиционных методов, таких как AP-MS.

Однако высокопроизводительные методы исследования эпистатических взаимосвязей сталкиваются с трудностями, поскольку количество возможных пар генов чрезвычайно велико (~ 20 миллионов у S. cerevisiae), а предполагаемая плотность генетических взаимодействий довольно низка.[8] Этим трудностям можно противостоять, исследуя все возможные взаимодействия в одном кластере генов, а не исследуя пары по всему геному. При правильном выборе эти функциональные кластеры содержат значительно более высокую плотность генетических взаимодействий, чем другие области генома, и, таким образом, обеспечивают более высокую скорость обнаружения при значительном сокращении количества пар генов, которые необходимо исследовать.[8]

Получение мутантных штаммов: DAmP

Получение данных для E-MAP зависит от создания тысяч двойных мутантных штаммов; исследование 483 аллелей, например, привело к E-MAP с ~ 100 000 различных пар двойных мутантов. Однако создание библиотек основных мутантов генов представляет значительные трудности, поскольку эти мутации имеют летальный фенотип. Таким образом, исследования E-MAP опираются на штаммы с промежуточными уровнями экспрессии этих генов. Стратегия снижения численности за счет пертурбации матричной РНК (DAmP) особенно характерна для высокопроизводительного поколения мутантов, необходимых для такого рода анализа, и позволяет частично разрушать основные гены без потери жизнеспособности.[9] DAmP полагается на дестабилизацию мРНК стенограммы путем интеграции антибиотик выбираемый маркер в 3’UTR, ниже по потоку стоп-кодон (фигура 2). мРНК с 3’-удлиненными транскриптами быстро становятся мишенями для деградации, и в результате происходит подавление интересующего гена, пока он остается под контролем своего природного промотора. В случае несущественных генов можно использовать штаммы с делециями. Маркировка участков делеции с помощью молекулярных штрих-кодов, уникальных последовательностей длиной 20 п.н., позволяет идентифицировать и изучать относительные уровни приспособленности в каждом мутантном штамме.

Рекомендации

  1. ^ а б Roth, F .; Липшиц, Х. и Эндрюс, Б. (2009). «Q&A: Epistasis». J. Biol. 8 (4): 35. Дои:10.1186 / jbiol144. ЧВК  2688915. PMID  19486505.
  2. ^ а б Яснос Л., Корона Р. (апрель 2007 г.). «Эпистатическая буферизация потери пригодности в дрожжевых штаммах с двойной делецией». Природа Генетика. 39 (4): 550–554. Дои:10,1038 / ng1986. PMID  17322879.
  3. ^ Fiedler, D .; и другие. (2009). «Функциональная организация сети фосфорилирования S. cerevisiae». Клетка. 136 (5): 952–963. Дои:10.1016 / j.cell.2008.12.039. ЧВК  2856666. PMID  19269370.
  4. ^ «Фактор транскрипции Lin-26 lin-26 [Caenorhabditis elegans] - Ген - NCBI».
  5. ^ "Lin-36 Protein lin-36 [Caenorhabditis elegans] - Ген - NCBI".
  6. ^ "DST1 Dst1p [Saccharomyces cerevisiae S288C] - Ген - NCBI".
  7. ^ Коллинз; и другие. (2007). «Функциональное рассечение белковых комплексов, участвующих в биологии дрожжевых хромосом с использованием карты генетического взаимодействия». Природа. 446 (12): 806–810. Bibcode:2007Натура 446..806С. Дои:10.1038 / природа05649. PMID  17314980.
  8. ^ а б Шульдинер; и другие. (2005). «Исследование функции и организации пути раннего секреторного дрожжевого грибка с помощью эпистатического профиля миниатюрного массива». Клетка. 123 (3): 507–519. Дои:10.1016 / j.cell.2005.08.031. PMID  16269340.
  9. ^ Шульдинер; и другие. (2006). «Количественный генетический анализ Saccharomyces cerevisiae с использованием эпистатических миниатюрных профилей (E-MAP) и его применение к функциям хроматина». Методы. 40 (4): 344–352. Дои:10.1016 / j.ymeth.2006.07.034. PMID  17101447.