Пятно фтор-нефрит - Fluoro-Jade stain

Положительные по флуоро-нефриту В нейроны в коре головного мозга крыс после инъекции каиновой кислоты

Пятно фтор-нефрит это флуорохром происходит от флуоресцеин, и обычно используется в нейробиология дисциплины для обозначения дегенерирующий нейроны в ex vivo ткань Центральная нервная система. О первом производном фтор-нефрита сообщил Ларри Шмуед в 1997 году как о методе, альтернативном традиционным методам маркировки дегенерирующих нейронов, таких как нитрат серебра окрашивание, H&E пятно, или же Пятно Ниссля.[1] Fluoro-Jade может быть предпочтительнее других дегенеративных пятен из-за простоты процедуры окрашивания и визуальной интерпретации, которые являются общими недостатками обычных дегенеративных пятен. Однако механизм, с помощью которого флюоро-нефрит маркирует дегенерирующие нейроны, неизвестен, что вызывает некоторые противоречия в отношении фактического физиологического состояния меченых клеток.

Химические свойства

В настоящее время существует три фторо-нефритовых красителя (Fluoro-Jade,[1] Фторо-нефрит B,[2] и фтор-нефрит C [3]), все из которых анионный производные флуоресцеина и высоко кислый.[3] В частности, Fluoro-Jade представляет собой смесь динатриевых солей 5-карбоксифлуоресцеина и 6-карбоксифлуоресцеина, тогда как Fluoro-Jade B представляет собой смесь (1) тринатрий-5- (6-гидрокси-3-оксо-3H-ксантен-9ил) бензола. , 1,2,4-трикарбоновая кислота, (2) динатрий 2- (6-гидрокси-3-оксо-3H-ксантен-9ил) -5- (2,4-дигидроксибензол) терефталевая кислота и (3) динатрий 2, 5-бис (6-гидрокси-3-оксо-3H-ксантен-9ил) терефталевая кислота.[4] Все три вида фторо-нефрита имеют одинаковые возбуждение и выброс профили в виде флуоресцеина (возбуждение: 495 нм; испускание: 521 нм) и, таким образом, могут быть визуализированы с использованием фильтра флуоресцеина / FITC. Новые красители, фторо-нефрит B и фтор-нефрит C, были разработаны для улучшения отношения сигнал / шум, что позволило создать превосходные соединения для визуализации более тонкой морфологии нейронов, включая дендриты, аксоны и нервные окончания.

Общие техники окрашивания

Почти вся обработанная ткань совместима с фторнефритовым пятном, включая ткани грызунов (мышей и крыс), нечеловеческих приматов и людей. Установленная ткань поэтапно регидратируется с уменьшением концентрации алкоголь. Перманганат калия может использоваться для уменьшения окрашивания фона и защиты тканей от выцветания и фотообесцвечивания. Фторо-нефрит очень растворимый в воде и поэтому сначала растворяется в дистиллированная вода. Чтобы быть специфичным для дегенерирующих нейронов, фторнефрит необходимо использовать в кислой среде, поэтому фторжад дополнительно разбавляют в ледяная уксусная кислота. Перед сушкой и закрытием покровного стекла следует промыть ткань дополнительной водой.[1]

Процедуры окрашивания фтор-нефритом являются гибкими и поэтому могут быть адаптированы для совместимости с другими методами окрашивания, такими как иммуногистохимия. Можно внести несколько изменений в общие процедуры, такие как уменьшение инкубации перманганата калия, чтобы избежать нарушения иммунофлуоресцентный маркировка. Фон можно уменьшить с помощью альтернативных методов, таких как снижение температуры окрашивания или уменьшение концентрации фтор-нефрита, которые могут быть более совместимы с другими методами маркировки.[1] Однако такие изменения следует определять эмпирически, чтобы оптимизировать конкретные экспериментальные условия.

В дополнение к окрашиванию ткани от подвергшихся лечению субъектов следует включать положительный и отрицательный контроли для обеспечения специфичности и достоверности метода. Обычно включают ткань от необработанных контрольных субъектов, чтобы показать специфичность для дегенерирующих нейронов, поскольку флюоро-нефрит не должен окрашивать не дегенерирующую ткань. Дополнительно включен положительный контроль, чтобы гарантировать достоверность процедуры окрашивания; чтобы показать, что дегенерирующие нейроны будут окрашены фторнефритом. Приемлемый положительный контроль включает нейродегенеративную ткань субъектов, у которых фторнерит уже был подтвержден, таких как животные, получавшие каиновую кислоту.

Анализ

Ткани, окрашенные фтор-нефритом, можно визуализировать под эпифлуоресцентный микроскоп с использованием системы фильтрации, разработанной для флуоресцеина или изотиоцината флуоресцеина (FITC) (возбуждение: 495 нм; испускание: 521 нм). Множественные морфологические особенности могут быть обнаружены с помощью фторнефритового окрашивания, включая клеточные тела, дендриты, аксоны, и терминалы аксонов.[1] Несмотря на то, что все производные фтор-нефрита могут обнаруживать эти специфические морфологические особенности, более новые производные (FlJb и FlJc) обладают большей специфичностью и разрешением и, следовательно, превосходят их в обнаружении более тонких морфологических особенностей.[3] Fluorojade обычно количественно определяется на каждом 6–12-м сечении 40 нм в интересующей области и выражается в количестве клеток / сечение. В качестве альтернативы можно использовать стереологические процедуры для оценки общего количества клеток, положительных по флуороиду, в определенной области.

Проверка техники

Поскольку механизм мечения фторо-нефритом неизвестен, для проверки этой методики был использован корреляционный анализ с традиционными окрашиванием нейрональной дегенерации. Первоначально окрашивание фторнефритом сравнивали с методами окрашивания медью H&E и де Ольмоса в различных нейротоксичный модели нейродегенерации, такие как инъекция каиновая кислота, MPTP, или же многовалентный металлы. Каждое из этих нейротоксических воздействий вызывает дегенерацию нейронов, специфичных для области мозга, и, таким образом, может использоваться для определения специфичности фторнефрита. Действительно, эти исследования продемонстрировали, что флюоро-нефрит последовательно воспроизводил специфические для инсульта паттерны окрашивания нейрональной дегенерации, которые были идентичны паттернам окрашивания H&E и меди де Ольмоса после тех же нейротоксических воздействий. Эти результаты предполагают, что фторнерит является надежным маркером нейродегенерации.[1]

Ларри Шмуд предполагает, что основная «молекула смерти» экспрессируется поврежденными клетками и что высокоанионный и кислый фторнефрит может быть специфичным для этой мишени.[1] Дальнейшее подтверждение достоверности окрашивания фтор-нефритом и этой гипотезы - работа Ауэра. и другие.,[5] кто продемонстрировал, что другой анионный краситель, фуксиновая кислота, может успешно связываться с поврежденными нейронами после гипергликемический оскорбление предположительно тем же электростатическим механизмом, что и фторжад. Эти нейроны характеризовались смерть клетки морфология, в том числе конденсированная хроматин, нарушенный плазматическая мембрана, и нарушенный ядерная мембрана.

Хотя фторнефрит и окрашивание серебром де Ольмоса имеют одинаковый образец окрашивания в моделях нейротоксичности, между этими двумя методологиями есть внутренние различия, которые могут иметь физиологические последствия. Например, анализ динамики дегенерации нейронов между двумя методами показывает, что окрашивание серебром проявляется раньше после нейротоксического воздействия, что может свидетельствовать о том, что фторнефрит специфичен для более поздней, более совершенной стадии дегенеративного процесса.[6]

Приложения

Травматическое повреждение мозга[7][8]

Повреждение спинного мозга[9]

Болезнь Альцгеймера[10]

Старение[11]

Гладить[12][13]

Эпилепсия [6]

Алкоголизм[14]

Злоупотребление наркотиками[15]

Другой

Фторо-нефрит также может быть полезен для других целей, помимо маркировки дегенеративных нейронов мозга. Несколько отчетов продемонстрировали, что флюорожад также полезен для обнаружения глии, особенно реактивной астроглии. [16] и микроглия.[17] Таким образом, fluorojade можно использовать для оценки глиальных реакций, связанных с нейротоксичностью. Кроме того, другие исследования демонстрируют, что флюоро-нефрит также может маркировать нейроны вне ЦНС, такие как нейроны ганглиев задних корешков.[18] Наконец, фторнефрит может найти применение в ненейронных системах, поскольку исследователи сообщили о его использовании для оценки гибели клеток эпителиальных клеток почечных канальцев in vitro.[19] и in vivo.[20]

Рекомендации

  1. ^ а б c d е ж грамм Schmued LC; Альбертсон С; Сликкер-младший W (1997). «Fluoro-Jade: новый флуорохром для чувствительной и надежной гистохимической локализации дегенерации нейронов». Исследование мозга. 751 (1): 37–46. Дои:10.1016 / S0006-8993 (96) 01387-X. PMID  9098566.
  2. ^ Schmued LC, Hopkins KJ (август 2000 г.). «Fluoro-Jade B: высокоаффинный флуоресцентный маркер для локализации дегенерации нейронов». Исследование мозга. 874 (2): 123–30. Дои:10.1016 / S0006-8993 (00) 02513-0. PMID  10960596.
  3. ^ а б c Schmued LC, Stowers CC, Scallet AC, Xu L (февраль 2005 г.). «Fluoro-Jade C обеспечивает сверхвысокое разрешение и контрастное мечение дегенерирующих нейронов». Исследование мозга. 1035 (1): 24–31. Дои:10.1016 / j.brainres.2004.11.054. PMID  15713273.
  4. ^ Саркар, Сумит; Ларри Шмуэд (2011). «11». В Брэде Болоне; Марк Батт (ред.). Фундаментальная невропатология для патологов и токсикологов: принципы и методы. Джон Уайли и сыновья. п. Глава 11. ISBN  9781118002230.
  5. ^ Ауэр Р. Н .; Калимо Х .; Olsson Y .; Сиешё Б. К. (1985). «Временная эволюция гипогликемического повреждения головного мозга. I. Результаты световой и электронной микроскопии в коре головного мозга крыс». Acta Neuropathol. 67 (1–2): 13–24. Дои:10.1007 / bf00688120. PMID  4024866.
  6. ^ а б Пуарье Дж. Л., Чапек Р., Де Конинк И. (2000). «Дифференциальная прогрессия мечения темного нейрона и фторо-нефрита в гиппокампе крыс после индуцированного пилокарпином эпилептического статуса». Неврология. 97 (1): 59–68. Дои:10.1016 / S0306-4522 (00) 00026-9. PMID  10771339.
  7. ^ Андерсон, К.Дж .; Miller, K.M .; Fugaccia, I .; Шефф, С. (2005). «Региональное распределение окрашивания флуоро-нефрит B в гиппокампе после черепно-мозговой травмы». Экспериментальная неврология. 193 (1): 125–130. Дои:10.1016 / j.expneurol.2004.11.025. PMID  15817271.
  8. ^ Hellmich, H.L .; Capra, B .; Eidson, K .; Garcia, J .; Кеннеди, Д .; Uchida, T .; Петрушка, м .; Cowar, J .; DeWitt, D.S .; Прото, Д.С. (2005). «Дозозависимое повреждение нейронов после черепно-мозговой травмы». Исследование мозга. 1044 (2): 144–154. Дои:10.1016 / j.brainres.2005.02.054. PMID  15885213.
  9. ^ Андерсон, К.Дж .; Fugaccia, I .; Шефф, С. (2003). «Fluoro-Jade B окрашивает покоящиеся и реактивные астроциты в спинном мозге грызунов». J. Нейротравма. 20 (11): 1223–1231. Дои:10.1089/089771503770802899. PMID  14651809.
  10. ^ Damjanac, M .; Rioux Bilan, A .; Барьер, L .; Pontcharraud, R .; Энн, С .; Hugon, J .; Пейдж, Г. (2007). «Окрашивание флуоро-нефритом B как полезный инструмент для идентификации активированной микроглии и астроцитов в мышиных трансгенных моделях болезни Альцгеймера». Исследование мозга. 1128 (1): 40–49. Дои:10.1016 / j.brainres.2006.05.050. PMID  17125750.
  11. ^ Коломбо, Дж. А .; Пюссан, В. (2002). «Флюоро-нефрит окрашивает раннюю и реактивную астроглию в коре головного мозга приматов». J Histochem Cytochem. 50 (8): 1135–1137. Дои:10.1177/002215540205000815.
  12. ^ Дакворт, E.A.M .; Батлер, Т .; Collier, L .; Collier, S .; Пеннипакер, К. Р. (2006). «NF-kappaB защищает нейроны от ишемического повреждения после окклюзии средней мозговой артерии у мышей». Исследование мозга. 1088 (1): 167–175. Дои:10.1016 / j.brainres.2006.02.103. PMID  16630592.
  13. ^ Дакворт, E.A.M .; Bulter, T.L .; De Mesquita, D .; Collier, S.N .; Collier, L .; Пеннипакер, К. Р. (2005). «Временная очаговая ишемия у мышей: технические аспекты и закономерности явной нейродегенерации Fluoro-Jade». Исследование мозга. 1042 (1): 29–36. Дои:10.1016 / j.brainres.2005.02.021. PMID  15823250.
  14. ^ Obernier, J.A .; Bouldin, J.A .; Crews, F.T. (2002). «Пьянство этанолом у взрослых крыс вызывает некротическую гибель клеток». Алкоголь Clin Exp Res. 26 (4): 547–557. Дои:10.1111 / j.1530-0277.2002.tb02573.x. PMID  11981132.
  15. ^ Eisch, A.J .; Schmued, L.C .; Маршалл, Дж. Ф. (1998). «Характеристика повреждения кортикальных нейронов фтор-нефритовым маркированием после нейротоксического режима метамфетамина». Синапс. 30 (3): 329–333. Дои:10.1002 / (SICI) 1098-2396 (199811) 30: 3 <329 :: AID-SYN10> 3.0.CO; 2-В. PMID  9776136.
  16. ^ Андерсон, К.Дж .; Изабелла, Ф .; Шефф, С. (2003). «Фторо-нефрит окрашивает покоящиеся и реактивные астроциты в спинном мозге грызунов». J. Нейротравма. 20 (11): 1223–1231. Дои:10.1089/089771503770802899. PMID  14651809.
  17. ^ Damjanac, M .; Rioux Bilan, A .; Барьер, L .; Pontcharraud, R .; Энн, С .; Hugon, J .; Пейдж, Г. (2007). «Окрашивание флуро-нефритом B как полезный инструмент для идентификации активированной микроглии и астроцитов на мышиных трансгенных моделях болезни Альцгеймера». Исследование мозга. 1128 (1): 40–49. Дои:10.1016 / j.brainres.2006.05.050. PMID  17125750.
  18. ^ Hornfelt, M .; Эдстром, А .; Экстром, П.А.Р. (1999). «Повышение уровня цитозольной фосфолипазы А2 коррелирует с апоптозом нейронов верхних шейных и дорсальных корешков мышей». Письма о неврологии. 265 (2): 87–90. Дои:10.1016 / S0304-3940 (99) 00046-4. PMID  10327175.
  19. ^ Гу, Цян; Ланц, Сьюзен; Росас-Эрнандес, Гектор; Куэвас, Элвис; Али, Сайед Ф .; Paule, Merle G .; Саркар, Сумит (июнь 2014 г.). «Обнаружение цитотоксичности in vitro с использованием FluoroJade-C». Токсикология in vitro. 28 (4): 469–472. Дои:10.1016 / j.tiv.2014.01.007. PMID  24462471.
  20. ^ Икеда, Мизуко; Вакасаки, Руми; Шеннинг, Кэти Дж .; Свид, Томас; Ли, Чон Хон; Миллер, М. Берни; Чой, Хак Су; Андерсон, Шарон; Хатченс, Майкл П. (апрель 2017 г.). «Определение функции почек и повреждений с помощью флуориметрии в ближнем инфракрасном диапазоне при экспериментальном кардиоренальном синдроме». Американский журнал физиологии. Почечная физиология. 312 (4): F629 – F639. Дои:10.1152 / ajprenal.00573.2016. ЧВК  5407071. PMID  28077373.