Зависимая от лигирования мультиплексная амплификация зонда - Multiplex ligation-dependent probe amplification

Зависимая от лигирования мультиплексная амплификация зонда (MLPA)[1] это вариант мультиплекса полимеразной цепной реакции что позволяет усиление нескольких целей с помощью только одной грунтовка пара.[1] Он обнаруживает изменения числа копий на молекулярном уровне, а для анализа используются программы. Выявление делеций или дупликаций может указывать на патогенные мутации, поэтому MLPA является важным диагностическим инструментом, используемым в лабораториях клинической патологии во всем мире.

Описание

Пример экзон делеции, обнаруженные с помощью мультиплексной лигирования-зависимой амплификации зонда в Мышечная дистрофия Дюшенна пациент.

Каждый зонд состоит из двух олигонуклеотидов, которые распознают соседние сайты-мишени на ДНК. Один олигонуклеотид-зонд содержит последовательность распознается прямым праймером, другой содержит последовательность, распознаваемую обратным праймером. Только когда оба олигонуклеотида зонда гибридизуются с соответствующими мишенями, они могут быть перевязанный в законченный зонд. Преимущество разделения зонда на две части состоит в том, что амплифицируются только лигированные олигонуклеотиды, но не несвязанные олигонуклеотиды зонда. Если бы зонды не были разделены таким образом, последовательности праймеров на обоих концах вызывали бы амплификацию зондов независимо от их гибридизации с матричной ДНК, и продукт амплификации не зависел бы от количества целевых сайтов, присутствующих в образце. ДНК. Каждый полный зонд имеет уникальную длину, поэтому его результат ампликоны можно разделить и идентифицировать по (капиллярной) электрофорез. Это позволяет избежать ограничений разрешения мультиплексная ПЦР. Поскольку прямой праймер, используемый для амплификации зонда, флуоресцентно помеченный, каждый ампликон генерирует флуоресцентный пик, который может быть обнаружен капиллярным секвенатором. Сравнивая картину пиков, полученную на данном образце, с картиной, полученной на различных контрольных образцах, можно определить относительное количество каждого ампликона. Это соотношение является мерой соотношения, в котором целевая последовательность присутствует в образце ДНК.

Различные техники, включая DGGE (Денатурирующий градиентный гель-электрофорез ), DHPLC (Денатурирующая высокоэффективная жидкостная хроматография ) и SSCA (анализ однонитевой конформации) эффективно идентифицируют SNP, а также небольшие вставки и делеции. MLPA, однако, является одним из единственных точных и эффективных по времени методов обнаружения делеций и вставок генома (одного или нескольких полных экзонов), которые являются частыми причинами рака, такого как наследственный неполипозный колоректальный рак (HNPCC ), рака груди и яичников. MLPA может успешно и легко определить относительное количество копий всех экзонов в гене одновременно с высокой чувствительностью.

Относительная плоидность

Важное использование MLPA - определение относительной плоидность. Например, зонды могут быть разработаны для нацеливания на различные области хромосома 21 клетки человека. Сила сигнала зондов сравнивается с уровнем сигнала, полученным из эталонного образца ДНК, о котором известно, что он имеет две копии хромосомы. Если в тестовом образце присутствует дополнительная копия, ожидается, что сигналы будут в 1,5 раза превышать интенсивности соответствующих зондов от эталона. Если присутствует только одна копия, ожидается, что пропорция будет 0,5. Если у образца две копии, ожидается, что относительные силы зонда будут равны.

Анализ коэффициента дозировки

Анализ коэффициента дозировки - это обычный метод интерпретации данных MLPA.[2] Если a и b - сигналы от двух ампликонов в образце пациента, а A и B - соответствующие ампликоны в экспериментальном контроле, то коэффициент дозировки DQ = (a / b) / (A / B). Хотя коэффициенты дозировки можно рассчитать для любой пары ампликонов, обычно один из них является внутренним эталонным датчиком.

Приложения

MLPA облегчает амплификацию и обнаружение нескольких мишеней с помощью одной пары праймеров. В стандартной мультиплексной реакции ПЦР для каждого фрагмента требуется уникальная пара амплифицирующих праймеров. Эти праймеры, присутствующие в большом количестве, приводят к различным проблемам, таким как димеризация и ложное грунтование. С помощью MLPA можно добиться амплификации зондов. Таким образом, многие последовательности (до 40) могут быть амплифицированы и количественно определены с использованием только одной пары праймеров. Реакция MLPA быстрая, недорогая и очень простая в исполнении.

MLPA имеет множество приложений[3] включая обнаружение мутации и однонуклеотидный полиморфизм,[4] анализ ДНК метилирование,[5] относительный мРНК количественная оценка[6] хромосомная характеристика клеточных линий и образцов тканей,[7] определение количества копий гена,[8] обнаружение дупликаций и делеций у человека рак гены предрасположенности, такие как BRCA1, BRCA2, hMLH1 и чМШ2[9] и анеуплоидия решимость.[10] MLPA имеет потенциальное применение в пренатальная диагностика обе инвазивный[11] и неинвазивный[12]

Недавние исследования показали, что MLPA (а также другие варианты, такие как iMLPA) являются надежным методом инверсионной характеристики.[13]

Варианты

iMLPA

Различия между MLPA и iMLPA

Гинер-Дельгадо, Карла и др. описал вариант MLPA, сочетающий его с iPCR. Они называют этот новый метод iMLPA.[13] и его процедура такая же, как и у MLPA, но в начале необходимы два дополнительных шага:

  1. Во-первых, необходима обработка ДНК рестрикционными ферментами, которые разрезают обе стороны интересующей области.
  2. Фрагменты, полученные в результате переваривания, рециркуляризируются и связываются

Конструкция зонда очень похожа. Каждый зонд будет состоять из двух частей, которые имеют как минимум: целевая последовательность, который представляет собой область, которая содержит последовательность, комплементарную интересующей области, так что может происходить правильная гибридизация. И последовательность праймера в конце концов, это последовательность, дизайн которой варьируется, и это то, что позволяет создавать праймеры и последующую амплификацию фрагментов. Кроме того, одна из частей зонда обычно содержит наполнитель между последовательностью-мишенью и последовательностью праймера. Использование разных вставок позволяет идентифицировать зонды с одинаковыми последовательностями праймеров, но с разными последовательностями-мишенями, что является ключом для множественной амплификации нескольких разных фрагментов в одной реакции.

Следующий шаг продолжается с типичным протоколом MLPA.[1].

Рекомендации

  1. ^ а б Schouten JP, McElgunn CJ, Waaijer R, Zwijnenburg D, Diepvens F, Pals G (2002). «Относительное количественное определение 40 последовательностей нуклеиновых кислот с помощью мультиплексной амплификации зонда, зависимой от лигирования». Нуклеиновые кислоты Res. 30 (12): 57e – 57. Дои:10.1093 / nar / gnf056. ЧВК  117299. PMID  12060695.
  2. ^ Яу С.К., Бобров М., Мэтью К.Г., Эббс С.Дж. (1996). «Точная диагностика носителей делеций и дупликаций при мышечной дистрофии Дюшенна / Беккера с помощью флуоресцентного анализа доз». J. Med. Genet. 33 (7): 550–558. Дои:10.1136 / jmg.33.7.550. ЧВК  1050661. PMID  8818939.
  3. ^ Список статей, связанных с MLPA В архиве 2007-02-20 на Wayback Machine
  4. ^ Воликос Э., Робинсон Дж., Айттомаки К., Меклин Дж. П., Ярвинен Х., Вестерман А. М., де Руджи Ф. В., Фогель Т., Моеслейн Г., Лаунонен В., Томлинсон И. П., Сильвер АР, Аалтонен Л. А. (2006). «Делеции экзонных и целых генов LKB1 являются частой причиной синдрома Пейтца-Егерса». J. Med. Genet. 43 (5): e18. Дои:10.1136 / jmg.2005.039875. ЧВК  2564523. PMID  16648371.
  5. ^ Проктер М., Чжоу Л.С., Тан В., Джама М., Мао Р. (2006). «Молекулярная диагностика синдромов Прадера-Вилли и Ангельмана с помощью специфичного для метилирования анализа плавления и мультиплексной амплификации зонда, зависимой от лигирования» (PDF). Clin. Chem. 52 (7): 1276–1283. Дои:10.1373 / Clinchem.2006.067603. PMID  16690734.
  6. ^ Венер М., Мангольд Э., Зенгтеллер М., Фридрихс Н., Арец С., Фридл В., Проппинг П., Pagenstecher C (2005). «Наследственный неполипозный колоректальный рак: подводные камни при скрининге делеций в генах MSH2 и MLH1». Евро. J. Hum. Genet. 13 (8): 983–986. Дои:10.1038 / sj.ejhg.5201421. PMID  15870828.
  7. ^ Wilting SM, Snijders PJ, Meijer GA, Ylstra B, Van den IJssel PR, Snijders AM, Albertson DG, Coffa J, Schouten JP, van de Wiel MA, Meijer CJ, Steenbergen RD (2006). «Повышенное количество копий гена на хромосоме 20q часто встречается как при плоскоклеточном раке, так и при аденокарциноме шейки матки». Дж. Патол. 209 (2): 220–230. Дои:10.1002 / path.1966. PMID  16538612.
  8. ^ Введение в MLPA
  9. ^ Bunyan DJ, Eccles DM, Sillibourne J, Wilkins E, Thomas NS, Shea-Simonds J, Duncan PJ, Curtis CE, Robinson DO, Harvey JF, Cross NC (2004). «Дозировка генов предрасположенности к раку путем мультиплексной амплификации зонда, зависимой от лигирования». Br. J. Рак. 91 (6): 1155–1159. Дои:10.1038 / sj.bjc.6602121. ЧВК  2747696. PMID  15475941.
  10. ^ Гердес Т., Кирхгоф М., Линд А.М., Ларсен Г.В., Шварц М., Лундстин С. (2005). «Компьютерный скрининг пренатальной анеуплоидии на хромосомы 13, 18, 21, X и Y на основе мультиплексной лигирования-зависимой амплификации зонда (MLPA)». Евро. J. Hum. Genet. 13 (2): 171–175. Дои:10.1038 / sj.ejhg.5201307. PMID  15483643.
  11. ^ Хохстенбах Р., Мейер Дж., Ван де Брюг Дж., Фоссебельд-Хофф И., Янсен Р., ван дер Луайт РБ, Синке Р. Дж., Пейдж-Кристиаенс ГК, Плоос ван Амстел Дж. К., де Патер Дж. М. (2005). «Быстрое обнаружение хромосомных анеуплоидий в некультивируемых амниоцитах с помощью мультиплексной лигирования-зависимой амплификации зонда (MLPA)». Пренат. Диаг. 25 (11): 1032–1039. Дои:10.1002 / pd.1247. PMID  16231311.
  12. ^ Illanes S, Avent N, Soothill PW (2005). «Внеклеточная ДНК плода в материнской плазме: важный шаг вперед в увязке генетики плода с акушерским ультразвуком». Ультразвуковой акушерство. Гинеколь. 25 (4): 317–322. Дои:10.1002 / uog.1881. PMID  15789415.
  13. ^ а б Хинер-Дельгадо, К., Вильяторо, С., Лерга-Хасо, Дж., Гая-Видаль, М., Олива, М., Кастеллано, Д., ... и Олальде, И. (2019). Эволюционное и функциональное влияние обычных полиморфных инверсий в геноме человека. Связь с природой, 10(1), 1-14. https://doi.org/10.1038/s41467-019-12173-x

внешняя ссылка