Анализ отдельных частиц - Single particle analysis

Анализ отдельных частиц сегментирует и усредняет множество частиц из образца, что позволяет компьютерным алгоритмам преобразовывать отдельные изображения в объединенное «репрезентативное» изображение. Это позволяет улучшить соотношение сигнал / шум и может сочетаться с деконволюция для обеспечения ограниченного улучшения пространственного разрешения изображения.

Анализ отдельных частиц представляет собой группу связанных компьютерных методов обработки изображений, используемых для анализа изображений из просвечивающая электронная микроскопия (ТЕМ).[1] Эти методы были разработаны для улучшения и расширения информации, получаемой из изображений ПЭМ образцов твердых частиц, обычно белки или другие крупные биологические объекты, такие как вирусы. Отдельные изображения окрашенных или неокрашенных частиц очень шумный, и так трудно интерпретировать. Объединение нескольких оцифрованных изображений похожих частиц вместе дает изображение с более сильными и более легко интерпретируемыми характеристиками. Расширение этого метода использует методы отдельных частиц для создания трехмерная реконструкция частицы. С помощью криоэлектронная микроскопия появилась возможность создавать реконструкции с суб-нанометр разрешающая способность и почти атомное разрешение[2][3] сначала в случае высокосимметричных вирусов, а теперь и в случае более мелких асимметричных белков.[4]

Методы

Анализ отдельных частиц можно проводить как на отрицательно окрашенный и стекловидное тело, залитое льдом CryoTEM образцы. Методы анализа отдельных частиц, как правило, зависят от однородности образца, хотя методы работы с конформационная неоднородность разрабатываются.

Изображения (микрофотографии), ранее собираемые на пленку, оцифровываются с помощью высококачественных сканеров или с помощью встроенных CCD детекторы соединены с фосфоресцентным слоем. Сейчас для сбора изображений широко используются прямые детекторы электронов. Обработка изображений осуществляется с помощью специализированного программного обеспечения. программы (например[5]), часто работают на многопроцессорных компьютерные кластеры. В зависимости от образца или желаемых результатов могут быть выполнены различные этапы двух- или трехмерной обработки.

Выравнивание и классификация

Биологические образцы, и особенно образцы, заключенные в тонкие стекловидный лед, очень чувствительны к излучению, поэтому для изображения образца можно использовать только низкие дозы электронов. Эта низкая доза, а также вариации металлическое пятно Используемый (если используется) означает, что изображения имеют высокий уровень шума по сравнению с сигналом наблюдаемой частицы. Выровняв несколько похожих изображений друг с другом, чтобы они совпадали, а затем усреднив их, получилось изображение с более высоким соотношение сигнал шум может быть получен. Поскольку шум в основном распределен случайным образом, а основные характеристики изображения постоянны, путем усреднения интенсивности каждого пикселя по нескольким изображениям усиливаются только постоянные характеристики. Обычно оптимальное выравнивание (a перевод и вращение в плоскости) для сопоставления одного изображения с другим рассчитывается взаимная корреляция.

Однако микрофотография часто содержит частицы в нескольких различных ориентациях и / или формах, и поэтому для получения более репрезентативных средних значений изображений требуется метод, позволяющий группировать похожие изображения частиц вместе в несколько наборов. Обычно это выполняется с использованием одного из нескольких алгоритмов анализа данных и классификации изображений, таких как многовариантный статистический анализ и иерархическая восходящая классификация, или k-средства кластеризации.

Часто используются наборы данных из десятков тысяч изображений частиц, и для достижения оптимального решения необходимо итеративный используется процедура выравнивания и классификации, при которой сильные средние значения изображений, полученные в результате классификации, используются в качестве опорных изображений для последующего выравнивания всего набора данных.

Фильтрация изображений

Фильтрация изображений (полосовая фильтрация ) часто используется для уменьшения влияния высоких и / или низких пространственная частота информация в изображениях, которая может повлиять на результаты процедур выравнивания и классификации. Это особенно полезно в отрицательное пятно изображений. В алгоритмах используются быстрые преобразования Фурье (БПФ ), часто используя гауссовская форма мягкие маски в взаимное пространство для подавления определенных частотных диапазонов. Фильтры верхних частот удаляют низкие пространственные частоты (например, эффекты линейного изменения или градиента), оставляя более высокие частоты нетронутыми. Фильтры низких частот удаляют высокочастотные пространственные характеристики и размывают мелкие детали.

Функция передачи контраста

Из-за характера формирования изображения в электронном микроскопе светлое поле ПЭМ-изображения получены с использованием значительных недооценка. Это, наряду с особенностями, присущими системе линз микроскопа, создает размытие собранных изображений, видимых как функция разброса точки. Комбинированные эффекты условий визуализации известны как функция передачи контраста (CTF), и может быть аппроксимирован математически как функция в обратном пространстве. Специализированные методы обработки изображений, такие как переворот фазы и коррекция амплитуды. винеровская фильтрация может (хотя бы частично[6]) корректировать для CTF и допускать реконструкции с высоким разрешением.

Трехмерная реконструкция

Изображения, полученные с помощью просвечивающей электронной микроскопии, представляют собой проекции объекта, показывающие распределение плотности через объект, аналогичные медицинским рентгеновским лучам. Используя теорема о проекции Трехмерная реконструкция объекта может быть создана путем комбинирования множества изображений (2D-проекций) объекта, снятых с разных углов обзора. В идеале белки в стекловидном льду принимают случайное распределение ориентации (или углов обзора), что позволяет изотропный реконструкция, если используется большое количество изображений частиц. Это контрастирует с электронная томография, где углы обзора ограничены из-за геометрии образца / настройки изображения, что дает анизотропный реконструкция. Отфильтрованная обратная проекция является широко используемым методом создания трехмерных реконструкций в анализе отдельных частиц, хотя существует множество альтернативных алгоритмов.[3]

Перед реконструкцией необходимо оценить ориентацию объекта на каждом изображении. Было разработано несколько методов для определения относительной Углы Эйлера каждого изображения. Некоторые из них основаны на общих линиях (общие 1D-проекции и синограммы ), другие используют алгоритмы итеративного сопоставления проекций. Последний работает, начиная с простой стартовой 3D-модели с низким разрешением, сравнивает экспериментальные изображения с проекциями модели и создает новую 3D-модель для начальной загрузки решения.

Также доступны методы для создания 3D-реконструкции спиральный образцы (например, вирус табачной мозаики ), пользуясь присущей спиральная симметрия. Для этих образцов можно использовать как методы реального пространства (рассматривая участки спирали как отдельные частицы), так и методы обратного пространства (с использованием дифракционных картин).

Методы наклона

Предметный столик микроскопа может быть наклонен (обычно по одной оси), что позволяет использовать метод одиночных частиц, известный как случайный наклон конуса.[7] Область образца отображается как под нулевым, так и под большим углом (~ 60-70 градусов) наклоном, или в случае родственного метода измерения реконструкция ортогонального наклона, +45 и −45 градусов. Выбираются пары частиц, соответствующие одному и тому же объекту с двумя разными наклонами (пары наклона), и, следуя параметрам, используемым на последующих этапах выравнивания и классификации, можно относительно легко создать трехмерную реконструкцию. Это потому, что угол обзора (определяемый как три Углы Эйлера ) каждой частицы известно из геометрии наклона.

3D-реконструкции из случайного конического наклона страдают от потери информации из-за ограниченного диапазона ориентации. Известный как недостающий конус (из-за формы в обратном пространстве) это вызывает искажения в 3D-картах. Однако проблему отсутствия конуса часто можно решить, комбинируя несколько реконструкций наклона. Методы наклона лучше всего подходят для отрицательно окрашенный образцы, и может быть использован для частиц, которые адсорбируются на углеродном носитель пленку в предпочтительной ориентации. Явление, известное как зарядка или движение под действием луча затрудняет сбор изображений образцов в стекловидном льду с большим наклоном.

Визуализация и подгонка карты

Различное программное обеспечение программы доступны, позволяющие просматривать 3D-карты. Они часто позволяют пользователю вручную стыковать координаты белков (структуры из Рентгеновская кристаллография или ЯМР) субъединиц в электронную плотность. Некоторые программы также могут соответствовать подсистемам с точки зрения вычислений.

Примеры

  • Важная информация о синтезе белка, связывание лиганда и взаимодействие РНК может быть получено с использованием этой новой техники при средних разрешениях от 7,5 до 25 Å.[8]
  • Метанококк марипалудис шаперонин,[9] реконструировано с разрешением 0,43 нанометра.[10] Этот бактериальный белковый комплекс представляет собой машину для сворачивания других белков, которые попадают в оболочку.
  • Синтаза жирных кислот[11] из дрожжей с разрешением 0,59 нанометра.[12] Этот огромный ферментный комплекс отвечает за образование длинноцепочечных жирных кислот, необходимых для жизни клеток.
  • Реконструкция 0,33 нм Акварель.[13][14] Эти вирусы поражают рыб и других водных животных. Реконструкция имеет достаточно высокое разрешение, чтобы можно было легко увидеть плотности боковых цепей аминокислот.

Первичная база данных

Рекомендации

  1. ^ Франк, Иоахим (2006). Трехмерная электронная микроскопия макромолекулярных ансамблей: визуализация биологических молекул в их естественном состоянии. Оксфорд: Издательство Оксфордского университета. ISBN  978-0-19-518218-7.[страница нужна ]
  2. ^ Чжоу Чж (апрель 2008 г.). «К атомному разрешению структурного определения с помощью одночастичной криоэлектронной микроскопии». Текущее мнение в структурной биологии. 18 (2): 218–28. Дои:10.1016 / j.sbi.2008.03.004. ЧВК  2714865. PMID  18403197.
  3. ^ а б Ван Кью, Мацуи Т., Домитрович Т., Чжэн Ю., Doerschuk PC, Джонсон Дж. Э. (март 2013 г.). «Динамика крио-электромагнитных реконструкций, визуализированная с помощью карт дисперсии, полученных с максимальным правдоподобием». Журнал структурной биологии. 181 (3): 195–206. Дои:10.1016 / j.jsb.2012.11.005. ЧВК  3870017. PMID  23246781.
  4. ^ Бартесаги, Альберто; Мерк, Алан; Банерджи, Суджай; Мэттис, Дорин; У, Сюнву; Милн, Жаклин Л. С .; Субраманиам, Шрирам (05.06.2015). «Структура CryoTEM с разрешением 2,2 Å β-галактозидазы в комплексе с ингибитором проницаемости клеток». Наука. 348 (6239): 1147–1151. Bibcode:2015Научный ... 348.1147B. Дои:10.1126 / science.aab1576. ISSN  1095-9203. ЧВК  6512338. PMID  25953817.
  5. ^ "送 彩 金 38 满 100 提 现 _ 无需 申请 自动 送 彩 金 【官 网】".
  6. ^ Даунинг К. Х., Глэзер Р. М. (август 2008 г.). «Восстановление слабоконтрастных изображений, записанных с высокой степенью расфокусировки: проблема« двойного изображения », связанная с коррекцией CTF». Ультрамикроскопия. 108 (9): 921–8. Дои:10.1016 / j.ultramic.2008.03.004. ЧВК  2694513. PMID  18508199.
  7. ^ Radermacher M, Wagenknecht T, Verschoor A, Frank J (май 1987 г.). «Трехмерная реконструкция из серии случайных конических наклонов с одной экспозицией, примененной к 50S рибосомной субъединице Escherichia coli». Журнал микроскопии. 146 (Чт 2): 113–36. Дои:10.1111 / j.1365-2818.1987.tb01333.x. PMID  3302267.
  8. ^ Arias-Palomo E, Recuero-Checa MA, Bustelo XR, Llorca O (декабрь 2007 г.). «Трехмерная структура Syk-киназы, определенная с помощью одночастичной электронной микроскопии». Биохим. Биофиз. Acta. 1774 (12): 1493–9. Дои:10.1016 / j.bbapap.2007.10.008. ЧВК  2186377. PMID  18021750.
  9. ^ Банк данных японского белка http://www.pdbj.org/emnavi/emnavi_movie.php?id=5137
  10. ^ Чжан Дж., Бейкер М.Л., Шредер Г.Ф. и др. (Январь 2010 г.). «Механизм закрытия складной камеры в шаперонине II группы». Природа. 463 (7279): 379–83. Bibcode:2010Натура.463..379Z. Дои:10.1038 / природа08701. ЧВК  2834796. PMID  20090755.
  11. ^ Банк данных японского белка http://www.pdbj.org/emnavi/emnavi_movie.php?id=1623
  12. ^ Гипсон П., Миллс Д. Д., Ваутс Р., Гринингер М., Вонк Дж., Кюльбрандт В. (май 2010 г.). «Прямое структурное понимание механизма перемещения субстрата дрожжевой синтазы жирных кислот с помощью электронной криомикроскопии». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 107 (20): 9164–9. Bibcode:2010PNAS..107.9164G. Дои:10.1073 / pnas.0913547107. ЧВК  2889056. PMID  20231485.
  13. ^ Банк данных японского белка http://www.pdbj.org/emnavi/emnavi_movie.php?id=5160
  14. ^ Чжан X, Цзинь Л., Фанг Ц., Хуэй ВХ, Чжоу Чж (апрель 2010 г.). «3.3 Крио-ЭМ структура вируса без оболочки раскрывает механизм прайминга для входа в клетку». Клетка. 141 (3): 472–82. Дои:10.1016 / j.cell.2010.03.041. ЧВК  3422562. PMID  20398923.

внешняя ссылка

Библиотечные ресурсы о
Анализ отдельных частиц