Удар и дыра - Википедия - Bump and hole

Схема ударно-пробивного метода.[1]

В ямочный метод инструмент в химическая генетика для изучения конкретных изоформа в белковой семье, не беспокоя других членов семьи. Недостижимость избирательного ингибирования изоформ из-за структурной гомологии в семействах белков является серьезной проблемой химической генетики. При подходе с выемками и отверстиями белок-лиганд интерфейс разработан для достижения избирательности за счет стерический комплементарность при сохранении биохимической компетентности и ортогональности к паре дикого типа. Как правило, аналог лиганда / ингибитора с «ударом» конструируется для связывания соответствующего «дырочно-модифицированного» белка. Ударные лиганды обычно представляют собой более объемные производные кофактор целевого белка. Белки с модифицированными отверстиями рекомбинантно экспрессируется с заменой аминокислот с большего остатка на меньший, например глицин или аланин на сайте связывания кофактора. Разработанный лиганд / ингибитор обладает специфичностью к сконструированному белку из-за стерической комплементарности, но не к нативному аналогу из-за стерического вмешательства.[1]

История

Вдохновение для метода ударов и отверстий было почерпнуто у мутанта Кишечная палочка штаммы, несущие мутантную версию фенилаланина A294S тРНК синтетаза и пережил воздействие п-FluoroPhe, слегка увеличенный аналог фенилаланина, который является цитотоксичным при включении в перевод. Мутантный штамм A294S был способен включать Phe, но не удавался п-FluoroPhe из-за стерического вытеснения гидроксиметилена S294.[2] Позже работа в лабораториях Питер Г. Шульц и Дэвид А. Тиррелл показали, что дырочно-модифицированный мутант фенилаланин-тРНК синтетазы A294G способен включать п-FluoroPhe в переводе, демонстрируя, что стерические манипуляции могут успешно расширить объем субстрата, даже для высокоспецифичной аминоацилсинтетазы.[3]

Первая заявленная пара «шишка-ямка». Дырко-модифицированный мутантный циклофилин S99T / F113A имеет расширенный гидрофобный карман для приема метильной нити в аналоге циклоспорина A MeIle11CsA.[4]

Первая пара шишек и дыр, разработанная Стюарт Шрайбер и его коллеги циклоспорин А небольшая молекула с Ile, заменяющим Val в положении 11, и дырочно-модифицированная (S99T / F113A) циклофилин мутант.[5] Циклоспорин А - это химический индуктор димеризации (ХИД) циклофилина. Эта первая пара выступов и отверстий была разработана для повышения эффективности связывания циклоспорина А дикого типа с циклофилином, тем самым обеспечивая более эффективный CID. Было обнаружено, что подвергнутый ударному воздействию циклоспорин A эффективно взаимодействует с дырочно-модифицированным мутантом циклофилина, но не с эндогенным циклофилином. Ортогональная пара CID использовалась для подавления кальциневрин -опосредованный дефосфорилирование ядерного фактора активированного Т-клетки специфическим для клеток и тканей образом.[6] Совсем недавно эта первая пара выступов и отверстий использовалась, чтобы стимулировать сборку десять-одиннадцать транслокация 2 диоксигеназа в клетках для временного контроля Деметилирование ДНК.[7]


Приложения

По мере того, как стала доступной структурная информация о границах раздела белок-лиганд, пары выступов и отверстий были использованы для выяснения субстратов конкретных белков из различных классов белков, а также для разработки ортогональных терапевтических средств неофермент-неосубстрат.

Киназы

Ударенный аналог АТФ N6-циклопентил АТФ не может связывать киназу v-Src дикого типа, но может связывать свою пару выступов и отверстий, киназу v-Src I338G.[8]

Человеческий белок киназы использовать АТФ как кофактор фосфорилат субстратные белки. Киназы играют важную роль в сложных сигнальных сетях клеток. Консервативные сайты связывания АТФ и аналогичные каталитические механизмы создают проблему для селективного ингибирования конкретной киназы для определения ее функции. Кеван Шокат lab разработала пары «шишка и дырка» с использованием мутантов киназы с объемными «привратниками» в АТФ-связывающем кармане, замененными на Gly или Ala, и объемных аналогов АТФ. В ранних работах было показано, что мутанты v-Src киназы I338A / G принимают [γ-32P] -мечен с выступом N6-циклопентил и N6Аналоги -бензил АТФ в качестве альтернативных кофакторов для радиоактивной метки его субстратов.[8] Только мутантная киназа была способна связывать подвергнутые ударному воздействию аналоги АТФ, позволяя маркировать субстраты, специфичные для сконструированной киназы v-Src. Очищение и Протеомика на основе МС дали субстраты киназы v-Src. Модифицированная дырочками киназа и пары аналогов АТФ позволили профилировать субстрат для нескольких других киназ, включая CDK1, Pho85, ERK2, и JNK.[9]

В то время как аналоги ATM с ударом могут способствовать деконволюции профилей субстрата киназы, одним из недостатков этой стратегии является непроницаемость для клеток с ударом аналогов. Чтобы обойти это, группа Shokat продемонстрировала, что аналог АТФ, кинетин АТФ или КТФ, может быть эндогенно синтезирован в клетках, культивируемых с кинетин. После синтеза он может активировать РОЗОВЫЙ1 мутант киназы, который в противном случае неактивен в отсутствии аналога с ударом. Неактивный PINK1 участвует в болезнь Паркинсона (PD). В контексте PD мутантная пара PINK1-KTP представляет собой ортогональный терапевтический неофермент-неосубстрат.[10]

Группа Shokat также применила метод «выпуклости и лунки» для разработки селективных, проницаемых для клеток ударных ингибиторов мутантных киназ. Для киназы v-Src I338G 4-амино-1-терт-бутил-3- (п-метилфенил) пиразоло [3,4-d] пиримидин (PP1) производное, называемое п-тButPhe-PP1 был разработан для селективного ингибирования; стерический объем препятствовал связыванию с киназой v-Src дикого типа. В клеточных линиях млекопитающих активная киназа v-Src требуется для трансформации посредством Вирус саркомы Рауса. В клеточных линиях, экспрессирующих киназу v-Src I338G и трансфицированных RSV, обработка п-тButPhe-PP1 вызывает обратную трансформацию, что позволяет предположить ингибирование мутанта киназы.[11] Позже группа разработала усиленные ингибиторы 1-нафтил PP1 (NA-PP1) и 1-метилнафтил PP1 (MN-PP1), которые ингибируют дырочно-модифицированные киназы дрожжей с IC50 значения в низких наномолярных концентрациях.[12]

BET белки

Ударенный ингибитор ЕТ обладает селективностью в отношении L94A BET BD из-за стерической комплементарности. Безударный ингибитор I-BET будет беспорядочно связывать BD.[13]

В ДЕРЖАТЬ ПАРИ Семейство белков (Bromodomains and Extra Terminal) содержит консервативные мотивы, известные как бромодомены (BD), ответственные за распознавание ацетилированный лизин на нуклеосомном гистоны.[14] Недавно четыре члена семейства BET, BRD2, 3, 4 и BRDT, каждый из которых содержит два бромодомена, были идентифицированы как важные регуляторы транскрипции.[15] Чтобы исследовать бромодомен-специфичные функции членов семейства BET, были разработаны низкомолекулярные ингибиторы JQ1 и I-BET, но им не хватало селективности между и внутри BET (между BD на одном и том же белке).[16] В лаборатории Алессио Чиулли были получены пары «шишка и дырка», состоящие из ET, производного I-BET с этиловым выступом, и различных членов семейства BET с мутацией L94A в их BD1.[13] Было обнаружено, что ЕТ имеет в 160 раз большую специфичность в отношении BD1, модифицированного по лункам, мутантов BET по сравнению с BD белков BET дикого типа, что дает BD-специфическое ингибирование. Пары выступов и отверстий BD-ET использовали для демонстрации того, что избирательное ингибирование BD1 в белке BET нарушает взаимодействие хроматина. Недавно группа Ciulli разработала новую пару «неровностей», состоящих из мутантов BET с мутацией Leu в Val в BD и низкомолекулярного ингибитора 9-ME-1. Было обнаружено, что этот усиленный ингибитор имеет IC50 200 нМ и более чем 100-кратную специфичность для мутантного BD L / V по сравнению с BD дикого типа. Эта пара выступов и отверстий позволила избирательно ингибировать специфические BD в определенных белках BET, выясняя их роль в клетках человека. Было обнаружено, что хотя BD1 важен для локализации белков BET в хроматине, BD2 регулирует экспрессию генов путем связывания и рекрутирования не ацетилированных гистонов белков, таких как факторы транскрипции.[17]

Гликозидазы

Схема ударного пролекарства и фермента, модифицированного дырочками, высвобождающего лекарство только в присутствии пары выпуклость и дырка.[18]

Гликозидазы представляют собой семейство ферментов, катализирующих гидролиз гликозидные связи. Эти ферменты могут отщеплять гликаны от гликозилированный белки, одна из наиболее распространенных форм посттрансляционная модификация. В недавнем терапевтическом применении метода ударов и отверстий модифицированный галактозидаза был соединен с усиленным галактозил-пролекарством. Цзинли Хоу и его коллеги стремились доставить оксид азота, важный посредник для стимулирования процессов роста тканей, таких как ангиогенез и васкулогенез, пространственно-временным контролем. Они выбрали пролекарство система, в которой NO-высвобождающее лекарство, NONOate, изначально гликозилирован. Как только гликозилированный NONOate входит в клетки и подвергается действию гликозидаз, высвобождается NO. Однако неспецифическое системное высвобождение NO, которое может снизить терапевтическую эффективность и вызвать вредные побочные эффекты, от этих пролекарств было очевидным из-за широкого распространения эндогенных гликозидаз. Чтобы обойти это, Hou et al. разработала усиленную пролекарство через метилирование O6 галактозного фрагмента галактозил-NONOate. Они сконструировали соответствующий дырочно-модифицированный мутант β-галактозидазы, A4-β-GalH363A со специфичностью в отношении удаляемого галактозил-NONOate. Ударенный пролекарство уклоняется от расщепления β-галактозидазой дикого типа из-за метилированного O6 фрагмента галактозы и строгого региоселективность гликозидаз. NO высвобождается в тканях только в присутствии как удаляемого галактозил-NONOата, так и дырочно-модифицированного мутанта β-галактозидазы, обеспечивая пространственно-временной контроль доставки. Hou et al. обнаружил заметно повышенную терапевтическую эффективность доставки NO через спроектированную систему с отверстиями по сравнению с немодифицированным пролекарством в задних конечностях крысы. ишемия и мышь острая травма почек модели.[18]

N-Ацетилгалактозаминилтрансферазы

BH GalNac-Ts с модифицированными отверстиями в паре с аналогами UDP-GalNac для маркировки субстратов GalNac T для визуализации с помощью химии щелчков.[19]

В N-Переносы семейства ацетилгалактозаминилтрансферазы (GalNac Ts) N-ацетилгалактозамин к боковым цепям Ser / Thr (О-связанное гликозилирование ) своих субстратов, используя UDP-GalNac в качестве кофактора. Как и киназы, профилирование субстрата для конкретных изоформ GalNac Ts было труднодостижимым. Отсутствие консенсусной последовательности гликозилирования и вариабельность выработки гликанов представляют проблему для изучения O-GalNac. гликопротеины. Кроме того, стратегии нокаута трансферазы GalNac неэффективны, поскольку активность изоформ в семействе является как избыточной, так и конкурентной, так что компенсация происходит при KO. Недавно Schumann et al. применил стратегию взрыва и отверстия для разработки алкинсодержащих UDP -Аналоги GalNac и модифицированный двойной лункой мутант I253A / L310A GalNac Ts (BH GalNac Ts). Аналоги UDP-алкинов специфичны для комплементарного BH GalNac Ts, которые, как было показано, поддерживают биохимическую компетентность GalNac Ts дикого типа в отношении структуры, локализации и субстратной специфичности. К этой паре выступов и отверстий прикреплена биоортогональная этикетка, визуализируемая через щелкните по химии, на субстратах различных изоформ GalNac T, деконволюция профилей субстратов при одновременном обнаружении сложности выработки гликанов в секреторном пути.[19]

Рекомендации

  1. ^ а б Ислам, Кабирул (октябрь 2018 г.). «Тактика выпадов и дырок: расширение возможностей химической генетики». Клеточная химическая биология. 25 (10): 1171–1184. Дои:10.1016 / j.chembiol.2018.07.001. ЧВК  6195450. PMID  30078633.
  2. ^ Каст, Питер; Хеннеке, Хауке (ноябрь 1991 г.). «Аминокислотная субстратная специфичность фенилаланил-тРНК синтетазы Escherichia coli изменена различными мутациями». Журнал молекулярной биологии. 222 (1): 99–124. Дои:10.1016 / 0022-2836 (91) 90740-В. PMID  1942071.
  3. ^ Лю, Чанг Ц .; Шульц, Питер Г. (07.06.2010). «Добавление новых химикатов в генетический код». Ежегодный обзор биохимии. 79 (1): 413–444. Дои:10.1146 / annurev.biochem.052308.105824. ISSN  0066-4154. PMID  20307192.
  4. ^ Белшоу, Питер Дж .; Schoepfer, Joseph G .; Лю Карен-Цянье; Моррисон, Ким Л .; Шрайбер, Стюарт Л. (1995-10-16). «Рациональный дизайн комбинаций ортогональных рецепторов и лигандов». Angewandte Chemie International Edition на английском языке. 34 (19): 2129–2132. Дои:10.1002 / anie.199521291. ISSN  0570-0833.
  5. ^ Шрайбер, Стюарт Л. (1998-08-01). «Химическая генетика - результат страсти к синтетической органической химии». Биоорганическая и медицинская химия. 6 (8): 1127–1152. Дои:10.1016 / S0968-0896 (98) 00126-6. ISSN  0968-0896. PMID  9784856.
  6. ^ Белшоу, Питер Дж .; Шрайбер, Стюарт Л. (февраль 1997 г.). «Клеточно-специфическое ингибирование кальциневрина модифицированным циклоспорином». Журнал Американского химического общества. 119 (7): 1805–1806. Дои:10.1021 / ja9636146. ISSN  0002-7863.
  7. ^ Ли, Минджунг; Ли, Цзя; Лян, Йи; Ма, Гуолинь; Чжан, Цзисян; Он, Лиан; Лю, Юлянь; Ли, Цянь; Ли, Миньонг; Сунь, Дэцян; Чжоу, Юбин (2017-04-05). «Разработанный фермент Split-TET2 для индуцируемого эпигенетического ремоделирования». Журнал Американского химического общества. 139 (13): 4659–4662. Дои:10.1021 / jacs.7b01459. ISSN  0002-7863. ЧВК  5385525. PMID  28294608.
  8. ^ а б Лю, Йи; Шах, Кавита; Ян, Фэн; Витаки, Лори; Шокат, Кеван М. (февраль 1998 г.). «Разработка протеинкиназ семейства Src с неестественной нуклеотидной специфичностью». Химия и биология. 5 (2): 91–101. Дои:10.1016 / S1074-5521 (98) 90143-0. PMID  9495830.
  9. ^ Уберсакс, Джеффри А .; Вудбери, Эрика Л .; Quang, Phuong N .; Параз, Мария; Блетроу, Джастин Д.; Шах, Кавита; Shokat, Kevan M .; Морган, Дэвид О. (октябрь 2003 г.). «Мишени циклин-зависимой киназы Cdk1». Природа. 425 (6960): 859–864. Bibcode:2003Натура.425..859U. Дои:10.1038 / природа02062. ISSN  0028-0836. PMID  14574415.
  10. ^ Герц, Николай Т .; Бертет, Амандин; Sos, Martin L .; Торн, Курт С .; Burlingame, Al L .; Накамура, Кен; Шокат, Кеван М. (август 2013 г.). «Нео-субстрат, который усиливает каталитическую активность киназы PINK1, связанной с болезнью Паркинсона». Клетка. 154 (4): 737–747. Дои:10.1016 / j.cell.2013.07.030. ЧВК  3950538. PMID  23953109.
  11. ^ Епископ, Энтони Ч .; Шах, Кавита; Лю, Йи; Витаки, Лори; Кунг, Чи-юнь; Шокат, Кеван М. (февраль 1998 г.). «Дизайн аллель-специфических ингибиторов для исследования передачи сигналов протеинкиназы». Текущая биология. 8 (5): 257–266. Дои:10.1016 / S0960-9822 (98) 70198-8. PMID  9501066.
  12. ^ Епископ, Энтони Ч .; Уберсакс, Джеффри А .; Petsch, Dejah T .; Matheos, Dina P .; Gray, Nathanael S .; Блетроу, Джастин; Симидзу, Эйдзи; Цзянь, Джо З .; Шульц, Питер Г .; Роза, Марк Д .; Вуд, Джон Л. (сентябрь 2000 г.). «Химический переключатель для чувствительных к ингибиторам аллелей любой протеинкиназы». Природа. 407 (6802): 395–401. Bibcode:2000Натура 407..395Б. Дои:10.1038/35030148. ISSN  0028-0836. PMID  11014197.
  13. ^ а б Baud, M. G.J .; Lin-Shiao, E .; Cardote, T .; Tallant, C .; Пщибул, А .; Chan, K.-H .; Zengerle, M .; Garcia, J. R .; Kwan, T. T.- L .; Фергюсон, Ф. М .; Чиулли, А. (2014-10-31). «Подход к разработке контролируемой селективности бромодоменных химических зондов по БЭТ». Наука. 346 (6209): 638–641. Bibcode:2014Наука ... 346..638B. Дои:10.1126 / science.1249830. ISSN  0036-8075. ЧВК  4458378. PMID  25323695.
  14. ^ Филиппакопулос, Панагис; Ци, Цзюнь; Пико, Сара; Шен, Яо; Смит, Уильям Б .; Федоров Олег; Морс, Элизабет М .; Китс, Трейси; Хикман, Тайлер Т .; Феллетар, Ильдико; Филпотт, Мартин (декабрь 2010 г.). «Селективное ингибирование бромодоменов BET». Природа. 468 (7327): 1067–1073. Bibcode:2010 Натур.468.1067F. Дои:10.1038 / природа09504. ISSN  0028-0836. ЧВК  3010259. PMID  20871596.
  15. ^ Ши, Цзянь; Ван, Ифань; Цзэн, Лэй; Ву, Яди; Дэн, Цзюн; Чжан, Цян; Линь Ивэй; Ли, Цзюньлинь; Канг, Тибанг; Тао, Мин; Русинова, Елена (февраль 2014 г.). «Нарушение взаимодействия BRD4 с диацетилированным твистом подавляет опухолеобразование при базальном раке молочной железы». Раковая клетка. 25 (2): 210–225. Дои:10.1016 / j.ccr.2014.01.028. ЧВК  4004960. PMID  24525235.
  16. ^ Филиппакопулос, Панагис; Ци, Цзюнь; Пико, Сара; Шен, Яо; Смит, Уильям Б .; Федоров Олег; Морс, Элизабет М .; Китс, Трейси; Хикман, Тайлер Т .; Феллетар, Ильдико; Филпотт, Мартин (декабрь 2010 г.). «Селективное ингибирование бромодоменов BET». Природа. 468 (7327): 1067–1073. Bibcode:2010 Натур.468.1067F. Дои:10.1038 / природа09504. ISSN  0028-0836. ЧВК  3010259. PMID  20871596.
  17. ^ Runcie, A.C .; Zengerle, M .; Chan, K.-H .; Testa, A .; van Beurden, L .; Baud, M.G.J .; Epemolu, O .; Ellis, L.C.J .; Читать, К. Д .; Coulthard, V .; Брайен, А. (2018). «Оптимизация подхода к аллель-селективному ингибированию бромодомена BET». Химическая наука. 9 (9): 2452–2468. Дои:10.1039 / C7SC02536J. ISSN  2041-6520. ЧВК  5909127. PMID  29732121.
  18. ^ а б Хоу, Цзинли; Пан, Ива; Чжу, Дашуай; Фань, Юэюань; Фэн, Гуовэй; Вэй, Юнчжэнь; Ван, Он; Цинь, Кан; Чжао, Течан; Ян, Цян; Чжу, Ян (февраль 2019). «Направленная доставка оксида азота с помощью пары фермент-пролекарство на основе« выпуклости и дырки »». Природа Химическая Биология. 15 (2): 151–160. Дои:10.1038 / s41589-018-0190-5. ISSN  1552-4450. PMID  30598545.
  19. ^ а б Шуман, Бенджамин; Малакер, Стейси Элис; Висновский, Симон Петр; Дебец, Марджоке Фрукье; Агбай, Энтони Джон; Фернандес, Даниэль; Вагнер, Лорен Ян Сарбо; Линь, Лян; Ли, Чжэнь; Чой, Чунвон; Фокс, Дуглас Майкл (апрель 2020 г.). «Инженерия с ударом и дырочкой выявляет специфические субстраты гликозилтрансфераз в живых клетках». Молекулярная клетка: S1097276520301982. Дои:10.1016 / j.molcel.2020.03.030. PMID  32325029.