Всплеск РНК - RNA spike-in

Трехмерный структура из РНК молекула. Вспышки РНК короткие синтетический РНК полимеры.

An Всплеск РНК является Транскрипт РНК известных последовательность и количество использовал к откалибровать измерения в РНК гибридизационные тесты, такие как Микрочип ДНК эксперименты, ОТ-КПЦР, и РНК-Seq.[1]

Втулка предназначена для привязки к ДНК молекула с последовательность соответствия, известный как контроль зонд.[2][3][4] Этот процесс специфического связывания называется гибридизация. Известное количество добавленной РНК смешивается с экспериментальным образцом во время приготовления.[2] Степень гибридизации между шипами и контрольными зондами используется для нормализовать измерения гибридизации образца РНК.[2]

История

Нуклеиновая кислота гибридизационные анализы использовались в течение десятилетий для обнаружения конкретных последовательностей ДНК или РНК,[5] с предшественником микрочипа ДНК, использованным еще в 1965 году.[6] В таких анализах положительный контроль олигонуклеотиды необходимы для обеспечения стандарта для сравнения концентрации последовательностей-мишеней, а также для проверки и корректировки неспецифическое связывание; то есть случайное связывание РНК с не-дополнительный Последовательности ДНК.[7] Эти элементы управления стали известны как «всплески».[1] С появлением микрочипов ДНК в 1990-х гг.[8] и коммерциализация высокопроизводительные методы секвенирования и анализы обнаружения РНК, производители «наборов» для гибридизационных анализов начали предоставлять заранее разработанные шипы.[1] На случай, если экспрессия гена микрочипы для анализа или Секвенирование РНК (RNA-seq), используются вставки РНК.

Производство

Основная статья: Синтез олигонуклеотидов

Спайки РНК могут быть синтезированы любым способом создания РНК. синтетически, или используя ячейки для расшифровывать ДНК в РНК in vivo (в камерах).[1] РНК может быть произведена in vitro (без ячейки) с помощью РНК-полимераза и ДНК с желаемой последовательностью.[1] Крупномасштабный биотехнология производители производят РНК синтетически с помощью высокопроизводительных технологий и предоставляют растворы для добавления РНК в заранее определенной концентрации.[1] Бактерии, содержащие ДНК (обычно на плазмиды ) для транскрипции в спайк-ин также коммерчески доступны.[1] Очищенная РНК может долгое время храниться в буферный раствор при низкой температуре.[1]

Приложения

Пример данных микрочипа ДНК. Яркие точки показывают места, где произошла гибридизация, указывая на то, что в образце присутствовала РНК соответствующей последовательности.

ДНК-микрочипы

Основная статья: Микрочип ДНК

ДНК-микрочипы твердый поверхности, обычно небольшой чип, к которому короткая ДНК полимеры известной последовательности ковалентно связанный.[6] Когда образец неизвестной РНК протекает по матрице, основания РНК соединяются и связываются с комплементарная ДНК.[6] Связанные транскрипты могут быть обнаружены, что указывает на присутствие РНК с соответствующей последовательностью.[6] Анализы ДНК-микрочипов полезны в исследованиях экспрессия гена, потому что многие транскрипты мРНК, присутствующие в клетке, могут быть обнаружены одновременно.[6] Всплески РНК известного количества могут обеспечить исходный уровень сигнал для сравнения с сигналом от транскриптов неизвестного количества, так что данные могут быть нормализованы внутри массива и между различными массивами.[2]

Последовательность действий

Основная статья: РНК-Seq

Секвенирование РНК (RNA-Seq) выполняется обратная расшифровка РНК к комплементарная ДНК (кДНК) и высокопроизводительное секвенирование кДНК.[9] Такие высокопроизводительные методы могут быть подвержены ошибкам, и для обнаружения и исправления ошибок необходимы известные средства управления.[9] Контроли с добавлением РНК могут обеспечить меру чувствительности и специфичности эксперимента RNA-Seq.[9]

Смотрите также

использованная литература

  1. ^ а б c d е ж г час Ян IV (2006). Использование внешнего контроля в экспериментах с микрочипами. Методы Энзимол. Методы в энзимологии. 411. С. 50–63. Дои:10.1016 / S0076-6879 (06) 11004-6. ISBN  9780121828165. PMID  16939785.
  2. ^ а б c d Фардин П., Моретти С., Биазотти Б., Риккарди А., Бонасси С., Варезио Л. (2007). «Нормализация микроматрицы низкой плотности с использованием внешних добавляемых контролей: анализ профиля экспрессии клеточных линий макрофагов». BMC Genomics. 8: 17. Дои:10.1186/1471-2164-8-17. ЧВК  1797020. PMID  17229315.
  3. ^ Уилкс Т., Локс Х, Фой Калифорния (2007). «Качество данных микрочипов - обзор текущих разработок». ОМИКС. 11 (1): 1–13. Дои:10.1089 / omi.2006.0001. PMID  17411392.
  4. ^ Шустер Э.Ф., Блан Э., Партридж Л., Торнтон Дж. М. (2007). «Оценка и коррекция неспецифического связывания в крупномасштабном эксперименте с добавлением импульсов». Геном Биол. 8 (6): R126. Дои:10.1186 / gb-2007-8-6-r126. ЧВК  2394775. PMID  17594493.
  5. ^ Южный, Эдвин М. (2001). «ДНК-микрочипы: история и обзор». Массивы ДНК. Методы молекулярной биологии ™. 170. Humana Press. стр.1–15. Дои:10.1385/1-59259-234-1:1. ISBN  9780896038226. PMID  11357674.
  6. ^ а б c d е Gillespie, D .; Шпигельман, С. (июль 1965 г.). «Количественный анализ гибридов ДНК-РНК с ДНК, иммобилизованной на мембране». Журнал молекулярной биологии. 12 (3): 829–842. Дои:10.1016 / с0022-2836 (65) 80331-х. ISSN  0022-2836. PMID  4955314.
  7. ^ Ян, Ивана В. (01.01.2006). «[4] Использование внешних контролей в экспериментах с микрочипами». Методы в энзимологии. Методы в энзимологии. ДНК-микрочипы, часть B: базы данных и статистика. 411. Академическая пресса. С. 50–63. Дои:10.1016 / S0076-6879 (06) 11004-6. ISBN  9780121828165. PMID  16939785.
  8. ^ Шена, Марк; Шалон, Дари; Дэвис, Рональд В .; Браун, Патрик О. (1995-10-20). «Количественный мониторинг паттернов экспрессии генов с помощью комплементарного ДНК-микрочипа». Наука. 270 (5235): 467–470. Дои:10.1126 / science.270.5235.467. ISSN  0036-8075. PMID  7569999.
  9. ^ а б c Цзян, Личунь; Шлезингер, Феликс; Дэвис, Кэрри А .; Чжан, Ю; Ли, Ренхуа; Салит, Марк; Gingeras, Thomas R .; Оливер, Брайан (01.09.2011). «Синтетические вспомогательные стандарты для экспериментов с RNA-seq». Геномные исследования. 21 (9): 1543–1551. Дои:10.1101 / гр.121095.111. ISSN  1088-9051. ЧВК  3166838. PMID  21816910.