Полиморфизм длины рестрикционного фрагмента - Википедия - Restriction fragment length polymorphism

В молекулярная биология, полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (RFLP) - это техника, использующая вариации гомологичный ДНК последовательности, известные как полиморфизмы, чтобы различать людей, популяции или виды или определять местонахождение гены внутри последовательности. Термин может относиться к самому полиморфизму, обнаруженному через различные местоположения сайты рестрикционных ферментов или к соответствующей лабораторной технике, с помощью которой можно проиллюстрировать такие различия. В RFLP анализ, образец ДНК расщепляется на фрагменты одним или несколькими рестрикционные ферменты, и в результате рестрикционные фрагменты затем разделяются гель-электрофорез согласно их размеру.

Хотя сейчас в значительной степени устарели из-за появления недорогих Секвенирование ДНК технологий, RFLP анализ был первым ДНК-профилирование техника достаточно недорогая, чтобы увидеть широкое применение. Анализ RFLP был важным ранним инструментом в картирование генома, локализация генов генетические нарушения, определение рисковать от болезней, и тестирование на отцовство.

RFLP анализ

Основной метод обнаружения RFLP включает фрагментацию образца ДНК с применением рестрикционный фермент, который может избирательно расщеплять молекулу ДНК везде, где короткое, специфический последовательность распознается в процессе, известном как ограничительный дайджест. Фрагменты ДНК, полученные в результате переваривания, затем разделяются по длине с помощью процесса, известного как электрофорез в агарозном геле и переносится на мембрану через Саузерн-блот процедура. Гибридизация мембраны на маркированный ДНК-зонд затем определяет длину фрагментов, которые дополнительный к зонду. Считается, что полиморфизм длины рестрикционного фрагмента возникает, когда длина детектируемого фрагмента варьируется у разных индивидуумов, что указывает на неодинаковую гомологию последовательностей. Длина каждого фрагмента считается аллель, действительно ли он содержит кодирующая область или нет, и может использоваться в последующем генетическом анализе.

Схема для RFLP по потере сайта расщепления
Анализ и наследование аллельных фрагментов RFLP (NIH)
Схема для RFLP по вариации длины VNTR

Примеры

Существует два общих механизма, с помощью которых может варьироваться размер конкретного рестрикционного фрагмента. На первой схеме небольшой сегмент геном обнаруживается ДНК-зондом (жирная линия). В аллеле Агеном расщепляется рестрикционным ферментом в трех соседних участках (треугольниках), но зонд обнаружит только крайний правый фрагмент. В аллеле асайт рестрикции 2 был утерян мутация, поэтому зонд теперь обнаруживает более крупный слитый фрагмент, проходящий от сайтов 1 до 3. Вторая диаграмма показывает, как эта вариация размера фрагмента будет выглядеть на Саузерн-блоте и как каждый аллель (два на человека) может быть унаследован членами семьи .

На третьей схеме зонд и рестрикционный фермент выбраны для обнаружения области генома, которая включает переменный номер тандемный повтор (VNTR) сегмент (прямоугольники на схеме). В аллеле c, в VNTR пять повторов, и зонд обнаруживает более длинный фрагмент между двумя сайтами рестрикции. В аллеле d, в VNTR есть только два повтора, поэтому зонд обнаруживает более короткий фрагмент между теми же двумя сайтами рестрикции. Другие генетические процессы, такие как вставки, удаления, транслокации, и инверсии, также может приводить к полиморфизму. Для RFLP-тестов требуются гораздо большие образцы ДНК, чем короткий тандемный повтор (STR) тесты.

Приложения

Анализ вариации ПДРФ в геномах раньше был жизненно важным инструментом в картировании генома и анализе генетических заболеваний. Если бы исследователи пытались изначально определить хромосомное расположение гена определенного заболевания, они бы проанализировали ДНК членов семьи, пораженной этим заболеванием, и искали бы аллели RFLP, которые показывают аналогичный образец наследования, как у самого заболевания (см. генетическая связь ). Как только ген болезни был локализован, RFLP-анализ других семей мог выявить, кто подвергался риску заболевания или кто мог быть перевозчик мутантных генов. ПДРФ-тест используется для идентификации и дифференциации организмов путем анализа уникальных паттернов в геноме. Он также используется для определения скорости рекомбинации в локусах между сайтами рестрикции.

Анализ RFLP был также основой для ранних методов генетическая дактилоскопия, полезно для идентификации образцов, полученных из преступление сцены, в определении отцовство, а в характеристике генетическое разнообразие или модели размножения в популяциях животных.

Альтернативы

Однако методика анализа RFLP медленная и громоздкая. Это требует большого количества образца ДНК и комбинированного процесса мечения зонда, фрагментации ДНК, электрофореза, блоттинга, гибридизации, промывки и авторадиография на выполнение может потребоваться до месяца. Ограниченная версия метода RFLP, который использовал олигонуклеотидные зонды было сообщено в 1985 году.[1] Результаты Проект генома человека в значительной степени заменили потребность в сопоставлении RFLP и идентификации многих однонуклеотидные полиморфизмы (SNP) в этом проекте (а также прямая идентификация многих генов болезней и мутаций) заменили потребность в анализе связи болезней RFLP (см. Генотипирование SNP ). Анализ аллелей VNTR продолжается, но сейчас его обычно проводят полимеразной цепной реакции (ПЦР) методы. Например, стандартный протоколы за Дактилоскопия ДНК включают ПЦР-анализ панели более десятка VNTR.

RFLP все еще используется в отборе с помощью маркеров. Полиморфизм длины концевого рестрикционного фрагмента (TRFLP или иногда T-RFLP) - это метод, первоначально разработанный для характеристики бактериальных сообществ в смешанных образцах. Этот метод также применялся к другим группам, включая почвенные грибы. TRFLP работает путем ПЦР-амплификации ДНК с использованием пар праймеров, которые были помечены флуоресцентными метками. Затем продукты ПЦР расщепляют с использованием ферментов RFLP, и полученные картины визуализируются с помощью секвенатора ДНК. Результаты анализируются либо путем простого подсчета и сравнения полос или пиков в профиле TRFLP, либо путем сопоставления полос из одного или нескольких прогонов TRFLP с базой данных известных видов. Техника в некоторых аспектах похожа на температурный градиент или же денатурирующий градиентный гель-электрофорез (ТГГЭ и ДГГЭ).

Изменения последовательности, непосредственно связанные с RFLP, также можно быстрее проанализировать с помощью ПЦР. Амплификация может быть направлена ​​через измененный сайт рестрикции, а продукты расщеплены рестрикционным ферментом. Этот метод получил название Расщепленная усиленная полиморфная последовательность (ШАПКИ). В качестве альтернативы амплифицированный сегмент можно проанализировать с помощью аллель-специфический олигонуклеотид (ASO) зонды - процесс, который часто можно выполнить с помощью простого точечный блот.

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ Saiki, R .; Шарф, S; Faloona, F; Mullis, K .; Рог, G .; Erlich, H .; Арнхейм, Н. (1985). «Ферментативная амплификация геномных последовательностей бета-глобина и анализ сайтов рестрикции для диагностики серповидноклеточной анемии». Наука. 230 (4732): 1350–1354. Bibcode:1985Научный ... 230.1350S. Дои:10.1126 / science.2999980. ISSN  0036-8075. PMID  2999980.

внешняя ссылка