Репрессилятор - Repressilator

В репрессилятор это генетическая регуляторная сеть состоящий как минимум из одного Обратная связь по крайней мере с тремя генами, каждый из которых экспрессирует белок, который репрессирует следующий ген в петле.[1] В биологических исследованиях репрессиляторы использовались для построения клеточных моделей и понимания функций клеток. Есть как искусственные, так и природные репрессиляторы. В последнее время встречающаяся в природе генная цепь часов репрессилятора в Arabidopsis thaliana (A. thaliana) и системы млекопитающих.

Искусственные репрессиляторы

Искусственные репрессиляторы впервые были разработаны Майкл Эловиц и Станислас Лейблер в 2000 г.,[2] дополняя другие исследовательские проекты, изучающие простые системы компонентов и функций клеток. Чтобы понять и смоделировать конструкцию и клеточные механизмы, обеспечивающие функцию клетки, Эловиц и Лейблер создали искусственную сеть, состоящую из петли с тремя транскрипционные репрессоры. Эта сеть была разработана с нуля, чтобы демонстрировать стабильные колебания, которые действуют как система электрических осцилляторов с фиксированными периодами времени. Сеть реализована в кишечная палочка (Кишечная палочка) посредством переноса рекомбинантной ДНК. Затем было подтверждено, что сконструированные колонии действительно проявляли желаемое колебательное поведение.

Репрессилятор состоит из трех генов, связанных в Обратная связь, так что каждый ген репрессирует следующий ген в петле и подавляется предыдущим геном. В синтетической вставке в E. Coli, зеленый флуоресцентный белок (GFP) использовался в качестве репортера, чтобы можно было наблюдать за поведением сети с помощью флуоресцентная микроскопия.

Генетическая регуляторная сеть репрессилятора, в которой каждый белок, транслируемый одним геном, репрессирует следующий в цикле.

При разработке репрессилятора руководствовались биологическими и схемными принципами с дискретный и стохастический модели анализа. Шесть дифференциальные уравнения были использованы для моделирования кинетики системы репрессиляторов на основе белка и мРНК концентрации, а также соответствующий параметр и Коэффициент Хилла значения. В исследовании Эловиц и Лейблер получили цифры показаны колебания белков-репрессоров с использованием интеграции и типичных значений параметров, а также стохастическая версия модели репрессилятора с использованием аналогичных параметров. Эти модели были проанализированы, чтобы определить значения различных скоростей, которые приведут к устойчивым колебаниям. Оказалось, что этим колебаниям способствуют промоутеры в сочетании с эффективным сайты связывания рибосом, кооперативные репрессоры транскрипции и сопоставимые скорости распада белков и мРНК.

Этот анализ мотивировал две особенности конструкции, которые были встроены в гены. Во-первых, промоторные области были заменены более эффективным гибридным промотором, который объединил Кишечная палочка фаг лямбда Промотор PL (λ PL) с лак репрессор (Lacl) и Тет репрессор (TetR) операторные последовательности. Во-вторых, чтобы уменьшить несоответствие между сроками жизни репрессорных белков и мРНК, a карбоксильный терминальный тег на основе последовательности ssrA-РНК была добавлена ​​на 3'-конце каждого гена-репрессора. Этот тег распознается протеазами, которые нацелены на деградацию белка. Дизайн был реализован с использованием малоформатной плазмида кодирование репрессилятора и репортера с более высокой копией, которые использовались для трансформации культуры Кишечная палочка.

Репрессиляторы естественного происхождения

Растения

Циркадные цепи у растений содержат петлю обратной связи регулятора транскрипции, называемую репрессилятором. в петля генератора сердечника (обведено серым) в A. thaliana, свет сначала воспринимают двое криптохромы и пять фитохромы. Два фактора транскрипции, Циркадные часы, связанные 1 (CCA1) и Поздний удлиненный гипокотиль (LHY), репрессируют гены, связанные с вечерней экспрессией, например Время выражения CAB 1 (TOC1) и активируют гены, связанные с утренней экспрессией, путем связывания с их промоторами. TOC1, вечерний ген, положительно регулирует CCA1 и LHY через неизвестный механизм.[3] Фактор вечерней транскрипции CCA1 Hiking Expedition (CHE) и гистоновая деметилаза jumonji C-домен, содержащий 5 (JMJD5) напрямую репрессируются CCA1. Было обнаружено, что другие компоненты экспрессируются в течение дня и прямо или косвенно ингибируют или активируют последующий элемент в циркадном цикле, тем самым создавая сложную, надежную и гибкую сеть петель обратной связи.[3]

Утренняя фаза экспрессии

Петля экспрессии утренней фазы относится к генам и белкам, которые регулируют ритмы в течение дня в организме человека. A. thaliana. Двумя основными генами являются LHY и CCA1, которые кодируют факторы транскрипции LHY и CCA1.[4] Эти белки образуют гетеродимеры которые входят в ядро ​​и связываются с TOC1 промотор гена, подавляющий продукцию белка TOC1. Когда белок TOC1 экспрессируется, он служит для регулирования LHY и CCA1 ингибированием их транскрипции. Позднее это было поддержано в 2012 году доктором Александрой Похило, которая использовала вычислительный анализ, чтобы показать, что TOC1 выполняет эту роль как ингибитор LHY и CCA1 выражение.[5] Утренняя петля служит для подавления гипокотиль удлинение, в отличие от петли вечерней фазы, которая способствует удлинению гипокотиля. Петля утренней фазы оказалась неспособной поддерживать циркадные колебания, когда гены экспрессии вечерней фазы мутировали.[5] предполагая взаимозависимость каждого компонента в этом природном репрессиляторе.

Вечерняя фаза выражения

Раннее цветение 3 (ELF3), Раннее цветение 4 (ELF4) и Фитоклок1 (ЛЮКС) являются ключевыми элементами в экспрессии генов с синхронизацией по вечерам в A. thaliana. Они образуют вечерний комплекс, в котором ЛЮКС связывается с промоутерами Фактор взаимодействия с фитохромом 4 (PIF4) и Фактор взаимодействия с фитохромом 5 (PIF5) и подавляет их.[3] В результате рано вечером происходит подавление удлинения гипокотилей. Когда торможение снимается поздно ночью, гипокотиль удлиняется. Фотопериод цветение контролируется выходным геном Гигантея (GI). GI активируется ночью и активирует выражение Констанс (CO), что активирует выражение Цветущий Локус Т (FT). FT затем вызывает цветение в долгие дни.[3]

Млекопитающие

У млекопитающих выработался эндогенный временной механизм для согласования физиологии и поведения с 24-часовым периодом.[6] В 2016 году исследователи определили последовательность из трех последующих ингибиторов в рамках этого механизма, которые они определили как репрессилятор, который, как теперь считается, служит основным ключевым элементом этой циркадной сети. Необходимость этой системы была установлена ​​после серии нокаутов генов среди криптохром (Плакать), период (За), и Rev-erb -- основные гены часов млекопитающих, нокауты которых приводят к аритмичности.[6] Модель, созданная этими исследователями, включает Bmal1 как драйвер транскрипции, опосредованной E-box, Per2 и Cry1 так рано и поздно Электронная коробка репрессоры, соответственно, а также регулятор D-бокса Dbp и ядерный рецептор Rev-erb-α. Последовательные запреты со стороны Rev-erb, За и Cry1 может генерировать устойчивые колебания, и за счет ограничения всех других компонентов, кроме этого репрессилятора, колебания сохраняются с аналогичными амплитудами и периодами.[6] Все колеблющиеся сети, кажется, включают любую комбинацию этих трех основных генов, как показано на различных схемах, выпущенных исследователями.

Недавняя работа

Модель репрессилятора использовалась для моделирования и изучения других биологических путей и систем. С тех пор была проделана большая работа по моделированию репрессилятора. В 2003 году репрессилятор представлял и проверял биологические модели, являющиеся моделью со многими переменными, с использованием системы Simpathica, которая подтвердила, что модель действительно колеблется со всеми ее сложностями.

Как указано в оригинальной работе Эловица и Лейблера, конечной целью исследований репрессиляторов является создание искусственных циркадных часов, которые отражают их естественный, эндогенный аналог. Это потребует разработки искусственных часов с уменьшенным шумом и температурной компенсацией, чтобы лучше понять циркадные ритмы, которые можно найти в каждом домен жизни.[7] Нарушение циркадных ритмов может привести к потере ритмичности в метаболический и транскрипционный процессов, и даже ускорить наступление определенных нейродегенеративные заболевания Такие как Болезнь Альцгеймера.[8] В 2017 году в лаборатории были созданы осцилляторы, которые генерировали циркадные ритмы и не сильно зависели от температуры.[6]

Патологически, модель репрессилятора может использоваться для моделирования роста клеток и аномалий, которые могут возникнуть, например, присутствующих в рак клетки.[9] При этом могут быть разработаны новые методы лечения, основанные на циркадной активности раковых клеток. Кроме того, в 2016 году исследовательская группа улучшила предыдущую конструкцию репрессилятора. Следующий шум (обработка сигнала) В ходе анализа авторы переместили репортерную конструкцию GFP на репрессилирующую плазмиду и удалили метки деградации ssrA с каждого репрессорного белка. Это увеличило период и улучшило регулярность колебаний репрессилятора.[10]

В 2019 году исследование продвинуло модель Эловица и Лейблера, улучшив систему репрессилятора, создав модель с уникальным устойчивое состояние и новая функция ставки. Этот эксперимент расширил современные знания о репрессиях и генная регуляция.[11]

Значимость

Синтетическая биология

Искусственные репрессиляторы были открыты путем имплантации синтетической петли ингибирования в Кишечная палочка. Это была первая реализация синтетических колебаний в организме. Дальнейшие последствия этого включают возможность восстановления мутировавших компонентов колебаний синтетическим путем в модельных организмах.[7]

Искусственный репрессилятор - это веха синтетической биологии, которая показывает, что генетические регуляторные сети могут быть разработаны и реализованы для выполнения новых функций. Однако было обнаружено, что колебания клеток смещаются по фазе через некоторое время, и на активность искусственного репрессилятора влияет рост клеток. Первоначальный эксперимент[7] поэтому дал новую оценку циркадные часы обнаружены у многих организмов, поскольку эндогенные репрессиляторы значительно более устойчивы, чем имплантированные искусственные репрессиляторы. Новые расследования в Центр количественной биологии RIKEN обнаружили, что химические модификации одной белковой молекулы могут формировать независимый от температуры самоподдерживающийся осциллятор.[12]

Искусственные репрессиляторы потенциально могут помочь исследованиям и лечению в самых разных областях - от биологии циркадных ритмов до эндокринологии. Они все в большей степени способны демонстрировать синхронизацию, присущую естественным биологическим системам и влияющим на них факторам.[13]

Циркадная биология

Лучшее понимание естественного репрессилятора в модельных организмах с эндогенным циркадным временем, например A. thaliana, имеет применение в сельском хозяйстве, особенно в выращивании растений и животноводстве.[14]

Рекомендации

  1. ^ Oliveira, Samuel M.D .; Chandraseelan, Jerome G .; Хаккинен, Антти; Goncalves, Nadia S.M .; Или-Харджа, Олли; Старцева, София; Рибейро, Андре С. (2015). «Одноклеточная кинетика репрессилятора при реализации в однокопийной плазмиде». Мол. Биосист. 11 (7): 1939–1945. Дои:10.1039 / c5mb00012b. PMID  25923804.
  2. ^ Станислас Лейблер; Эловиц, Майкл Б. (2000-01-20). «Синтетическая колебательная сеть регуляторов транскрипции». Природа. 403 (6767): 335–338. Bibcode:2000Натура.403..335E. Дои:10.1038/35002125. ISSN  1476-4687. PMID  10659856.
  3. ^ а б c d Кей, Стив А .; Нагель, Дон Х. (21 августа 2012 г.). «Сложность подключения и регулирования циркадных сетей растений». Текущая биология. 22 (16): R648 – R657. Дои:10.1016 / j.cub.2012.07.025. ISSN  0960-9822. ЧВК  3427731. PMID  22917516.
  4. ^ Сюй, Полли Иншань; Хармер, Стейси Л. (весна 2014 г.). «Колеса в колесах: циркадная система растений». Тенденции в растениеводстве. 19 (4): 240–249. Дои:10.1016 / j.tplants.2013.11.007. ISSN  1360-1385. ЧВК  3976767. PMID  24373845.
  5. ^ а б Похилко, Александра; Фернандес, Аврора Пиньяс; Эдвардс, Кирон Д.; Южный, Меган М; Холлидей, Карен Дж; Миллар, Эндрю Дж (13 марта 2012 г.). «Цепь часового гена у Arabidopsis включает репрессилятор с дополнительными петлями обратной связи». Молекулярная системная биология. 8: 574. Дои:10.1038 / msb.2012.6. ISSN  1744-4292. ЧВК  3321525. PMID  22395476.
  6. ^ а б c d Ву, Лили; Оуян, Ци; Ван, Хунли (02.02.2017). «Надежные сетевые топологии для генерации колебаний с периодами, не зависящими от температуры». PLoS ONE. 12 (2): e0171263. Bibcode:2017PLoSO..1271263W. Дои:10.1371 / journal.pone.0171263. ISSN  1932-6203. ЧВК  5289577. PMID  28152061.
  7. ^ а б c Синтетическая колебательная сеть регуляторов транскрипции; Майкл Эловиц и Станислас Лейблер; Природа. 2000, 20 января; 403 (6767): 335-8.
  8. ^ Гомолак, Ян; Мудровчич, Моника; Вукич, Барбара; Тольян, Карло (21.06.2018). «Циркадный ритм и болезнь Альцгеймера». медицинские науки. 6 (3): 52. Дои:10.3390 / medsci6030052. ISSN  2076-3271. ЧВК  6164904. PMID  29933646.
  9. ^ Шиманьска, Зузанна; Цитовски, Мацей; Митчелл, Элейн; Macnamara, Cicely K .; Капеллан Марк А. Дж. (Май 2018 г.). «Вычислительное моделирование развития и роста рака: моделирование в различных масштабах и моделирование в нескольких масштабах». Вестник математической биологии. 80 (5): 1366–1403. Дои:10.1007 / s11538-017-0292-3. HDL:10023/14364. ISSN  1522-9602. PMID  28634857.
  10. ^ Потвин-Троттье, Лоран; Господь, Натан Д .; Винникомб, Гленн; Паулссон, Йохан (27.10.2016). «Синхронные долговременные колебания в синтетической генной цепи». Природа. 538 (7626): 514–517. Bibcode:2016Натура.538..514П. Дои:10.1038 / природа19841. ЧВК  5637407. PMID  27732583.
  11. ^ Тайлер, Джонатан; Шиу, Энн; Уолтон, Джей (30 марта 2019 г.). «Возвращаясь к синтетической внутриклеточной регуляторной сети, которая демонстрирует колебания». Журнал математической биологии. 78 (7): 2341–2368. arXiv:1808.00595. Дои:10.1007 / s00285-019-01346-3. ISSN  1432-1416. PMID  30929046.
  12. ^ Джолли, Крейг С .; Ode, Koji L .; Уэда, Хироки Р. (2012). «Принцип построения посттрансляционного биохимического осциллятора». Отчеты по ячейкам. 2 (4): 938–950. Дои:10.1016 / j.celrep.2012.09.006. ISSN  2211-1247. PMID  23084745.
  13. ^ Гарсия-Охалво, Хорди; Elowitz, Майкл Б .; Строгац, Стивен Х. (27 июля 2004 г.). «Моделирование синтетических многоклеточных часов: репрессиляторы в сочетании с контролем кворума». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 101 (30): 10955–10960. Bibcode:2004ПНАС..10110955Г. Дои:10.1073 / pnas.0307095101. ISSN  0027-8424. ЧВК  503725. PMID  15256602.
  14. ^ Готтлиб, Дафна (29.06.2019). «Агро-хронобиология: интеграция циркадных часов / биологии времени в управление хранением». Журнал исследований хранимых продуктов. 82: 9–16. Дои:10.1016 / j.jspr.2019.03.003. ISSN  0022-474X.


внешняя ссылка