Биотинилирование - Biotinylation

В биохимия, биотинилирование это процесс ковалентного присоединения биотин к белку, нуклеиновой кислоте или другой молекуле. Биотинилирование происходит быстро, специфично и вряд ли нарушит естественную функцию молекулы из-за небольшого размера биотина (молекулярная масса = 244,31 г / моль). Биотин связывается с стрептавидин и авидин с чрезвычайно высоким сродством, быстрым действием и высокой специфичностью, и эти взаимодействия используются во многих областях биотехнологии для выделения представляющих интерес биотинилированных молекул. Связывание биотина со стрептавидином и авидином устойчиво к экстремальным температурам, pH и протеолизу, что делает возможным захват биотинилированных молекул в самых разных средах. Также множественный биотин молекулы возможно сопряженный к интересующему белку, что позволяет связывать несколько стрептавидин, авидин или же нейтравидин молекулы белка и увеличивает чувствительность обнаружения интересующего белка. Существует большое количество доступных реагентов для биотинилирования, которые используют широкий спектр возможных методов мечения. Из-за сильного сродства между биотином и стрептавидином очистка биотинилированных белков была широко используемым подходом для идентификации белок-белковых взаимодействий и посттрансляционных событий, таких как убиквитилирование[1] в молекулярной биологии.

Методы маркировки

Белки можно биотинилировать химически или ферментативно. В химическом биотинилировании используются различные химические процессы конъюгирования для получения неспецифического биотинилирования аминов, карбоксилатов, сульфгидрилов и углеводов (например, NHS-сочетание приводит к биотинилированию любых первичных аминов в белке). Ферментативное биотинилирование приводит к биотинилированию определенного лизина в определенной последовательности бактериальной биотинлигазой.[2] Большинство реагентов химического биотинилирования состоят из реакционноспособной группы, присоединенной через линкер к боковой цепи валериановой кислоты биотина. Поскольку биотин-связывающий карман в авидине / стрептавидине скрыт под поверхностью белка, желательны реагенты для биотинилирования, обладающие более длинным линкером, поскольку они позволяют молекуле биотина, когда она прикреплена к своей мишени, быть более доступной для связывания авидина / стрептавидина. / Белок нейтравидин. Этот линкер может также опосредовать растворимость реагентов биотинилирования; линкеры, которые включают полиэтиленгликоль (ПЭГ) может сделать нерастворимые в воде реагенты растворимыми или повысить растворимость реагентов биотинилирования, которые уже растворимы до некоторой степени.

Ферментативное биотинилирование

В отличие от методов химического биотинилирования, ферментативное биотинилирование позволяет биотину связываться точно с одним остатком, присутствующим в белке. Эта реакция биотинилирования также может завершиться, что означает, что продукт образуется с высокой однородностью и может быть связан с стрептавидин в определенной ориентации, например за Мультимеры MHC. Ферментативное биотинилирование чаще всего проводят Кишечная палочка биотин-холофермент-синтетаза, также известная как биотинлигаза (BirA, P06709).[3][4]

Наиболее распространенный способ нацеливания на интересующий белок - слияние белка на его N-конце, C-конце или во внутренней петле с пептидом из 15 аминокислот (GLNDIFEAQKIEWHE), называемый AviTag или акцепторным пептидом (AP).[5] После метки белок затем инкубируют с BirA, позволяя биотинилированию происходить в присутствии биотина и АТФ.[5] Ферментативное биотинилирование можно проводить in vitro но BirA также специфически реагирует со своим целевым пептидом внутри клеток млекопитающих и бактерий и на поверхности клетки, в то время как другие клеточные белки не модифицируются.[6][7][8] Также может происходить ферментативное биотинилирование in vivo обычно посредством совместной экспрессии белка, меченного Avitag, и BirA.[9]

Натуральный субстрат BirA - это белок-носитель карбоксила биотина (BCCP). Прежде чем были обнаружены более мелкие метки, для нацеливания необходимо было слить белок со всей BCCP.[10] Белок, слитый с BCCP, может распознаваться молекулами биотина. in vivo и прикрепить к нему.[11] До AviTag использовалось несколько других небольших тегов, но AviTag пока является наиболее эффективным.[4]

Биотинилирование первичного амина

Наиболее частые цели для модификации белок молекулы представляют собой первичные аминогруппы, которые представлены в виде боковой цепи лизина эпсилон-амины и N-концевые α-амины. Реагенты для биотинилирования, реагирующие с аминогруппами, можно разделить на две группы в зависимости от воды. растворимость.

N-гидроксисукцинимид (NHS) эфиры плохо растворяются в водный решения. Для реакций в водном растворе их сначала необходимо растворенный в органический растворитель, затем разбавили водным реакция смесь. Наиболее часто используемые органические растворители для этой цели: диметилсульфоксид (ДМСО) и диметилформамид (DMF), которые совместимы с большинством белков в низких концентрациях. Из-за гидрофобности сложных эфиров NHS реагенты для биотинилирования NHS также могут диффундировать через клеточная мембрана, что означает, что они будут биотинилировать как внутренние, так и внешние компоненты клетка.

Биотин NHS lysine Reaction.png

Сложные эфиры сульфо-NHS ​​более растворимы в воде, и их следует растворять в воде непосредственно перед использованием, поскольку они легко гидролизуются. Растворимость сульфо-NHS-эфиров в воде связана с их сульфонат группа по N-гидроксисукцинимид кольцо и устраняет необходимость растворять реагент в органическом растворителе. Сульфо-NHS-эфиры биотина также могут быть использованы в качестве реагентов для биотинилирования клеточной поверхности, поскольку они не проникают через клеточная мембрана.

Химические реакции сложных эфиров NHS и сульфо-NHS ​​по существу идентичны, поскольку оба они спонтанно реагируют с аминами с образованием амидной связи. Поскольку мишенью для сложного эфира является депротонированный первичный амин, реакция протекает в основных условиях (pH выше 7). Гидролиз эфира NHS является основной конкурирующей реакцией, и скорость гидролиза увеличивается с увеличением pH. NHS- и сульфо-NHS-эфиры имеют период полураспада несколько часов при pH 7, но всего несколько минут при pH 9.

Существует некоторая гибкость в условиях конъюгирования сложных эфиров NHS с первичными аминами. Температура инкубации может составлять от 4 до 37 ° C, значения pH в диапазоне реакции от 7 до 9, а время инкубации колеблется от нескольких минут до 12 часов. Буферы, содержащие амины (например, Трис или же глицин ) следует избегать, потому что они конкурируют с реакцией.

Сульфгидрил биотинилирование

Альтернативой биотинилированию первичного амина является мечение сульфгидрильных групп биотином. Потому что бесплатно сульфгидрил группы менее распространены в большинстве белков по сравнению с первичными аминами, сульфгидрилбиотинилирование полезно, когда первичные амины расположены в регуляторном домене (ах) целевого белка или когда требуется пониженный уровень биотинилирования. Сульфгидрил-реактивные группы, такие как малеимиды галогенацетилы и пиридилдисульфиды требуют свободных сульфгидрильных групп для сопряжения; сначала необходимо восстановить дисульфидные связи, чтобы освободить сульфгидрильные группы для биотинилирования. Если свободных сульфгидрильных групп нет, лизины можно модифицировать различными тиоляция реагенты (Реагент Траута, SAT (PEG4), SATA и SATP), что приводит к добавлению свободного сульфгидрила. Сульфгидрилбиотинилирование проводят при немного более низком pH (6,5-7,5), чем мечение эфирами NHS.

Биотин Maleimide Cysteine ​​Reaction.png

Помимо цельных белков, биотинилированный пептиды можно синтезировать, введя цистеин (Cys) остаток во время синтеза на конце аминокислотной цепи, чтобы получить сайт-специфическое и ориентированное биотинилирование. Нуклеотиды также можно биотинилировать путем включения биотинилированного нуклеотиды.

Карбоксильное биотинилирование

Карбоксильные группы находятся на С-концах белков и на боковых цепях глутамата и аспартата аминокислот. Реагенты для биотинилирования, которые нацелены на карбоксильные группы, не имеют карбоксил-реактивного фрагмента как такового, а вместо этого полагаются на карбодиимид сшивающий агент, такой как EDC для связывания первичного амина на реагентах биотинилирования с карбоксильной группой целевого белка.

Биотинилирование по карбоксильным группам происходит при pH 4,5–5,5. Чтобы предотвратить перекрестную реакцию сшивающего агента с компонентами буфера, буферы не должны содержать первичных аминов (например, Трис, глицин ) или карбоксилов (например, ацетат, цитрат ); МЧС буфер - идеальный выбор.

Биотинилирование гликопротеинов

Гликопротеины может быть биотинилирован путем модификации углевод остатки альдегиды, которые затем реагируют с гидразин - реагенты для биотинилирования на основе алкоксиамина. Периодат натрия окисляет сиаловые кислоты от гликопротеинов к альдегидам с образованием этих стабильных связей при pH 4–6.

Поликлональные антитела сильно гликозилированы, и поскольку гликозилирование не мешает активности антител, биотинилирование гликозильных групп является идеальной стратегией для создания биотинилированных антител.

Биотинилирование олигонуклеотидов

Олигонуклеотиды легко биотинилируются в процессе синтез олигонуклеотидов фосфорамидитным методом с использованием товарного фосфорамидита биотина.[12] После стандартного снятия защиты полученные конъюгаты могут быть очищены с помощью обращенно-фазовой или анионообменной ВЭЖХ.

Неспецифическое биотинилирование

Фотоактивируемые реагенты для биотинилирования идеальны, когда первичные амины, сульфгидрилы, карбоксилы и углеводы не доступны для маркировки. Эти реагенты зависят от арилазидов, которые активируются ультрафиолетовый свет (УФ;> 350 нм), которые затем реагируют по связям C-H и N-H. Поскольку эти типы связей возникают независимо от типа аминокислоты, этот тип биотинилирования называют «неспецифическим».

Фотоактивируемые реагенты для биотинилирования также можно использовать для активации биотинилирования в определенные моменты времени в эксперименте или в определенных условиях реакции, просто подвергая реакцию воздействию УФ-излучение в определенное время или при определенных условиях.

Цель

Очищение

Тег биотина можно использовать в аффинная хроматография вместе со столбцом, имеющим авидин (или же стрептавидин или же нейтравидин ), связанный с ним, который является естественным лигандом биотина. Однако для разрыва взаимодействия авидин / стрептавидин-биотин необходимы жесткие условия (например, 6M GuHCl при pH 1,5), что, скорее всего, денатурирует белок, несущий биотиновую метку. Если требуется выделение помеченного белка, лучше пометить белок иминобиотин. Этот аналог биотина дает прочное связывание с авидином / стрептавидином при щелочном pH, но сродство снижается при понижении pH. Следовательно, функциональный белок, меченный иминобиотином, может высвобождаться из колонки авидин / стрептавидин путем снижения pH (примерно до pH 4).[13][14]

Обнаружение

Этот тег также можно использовать для обнаружения белка через антибиотин. антитела или стратегии обнаружения, меченные авидином / стрептавидином, такие как репортеры ферментов (например, пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза ) или же флуоресцентные зонды. Это может быть полезно при локализации с помощью флуоресцентной или электронной микроскопии,[15] ELISA анализы, ELISPOT анализы, вестерн-блоты и другие иммуноаналитические методы. Обнаружение с помощью моновалентного стрептавидина позволяет избежать кластеризации или агрегации биотинилированной мишени.[16]

Другое использование

В нековалентная связь образующийся между биотином и авидином или стрептавидином имеет сродство связывания, которое выше, чем у большинства связей антигена и антитела, и приближается к силе Ковалентная связь. Это очень прочное связывание делает маркировку белков биотином полезным инструментом для таких приложений, как аффинная хроматография использование иммобилизованного авидина или стрептавидина для отделения биотинилированного белка от смеси других белков и биохимических веществ. Биотинилированный белок, такой как биотинилированный бычий сывороточный альбумин (БСА), используется в твердофазных анализах в качестве покрытия на поверхности лунок в многолуночных аналитических планшетах. Биотинилирование красные кровяные тельца был использован в качестве средства определения общего объема крови без использования радиоактивных меток, таких как хром 51, что позволяет определять объем у младенцев с низкой массой тела при рождении и беременных женщин, которые иначе не могли бы подвергнуться воздействию требуемых доз радиоактивности. Кроме того, биотинилирование Молекулы MHC создавать Мультимеры MHC стал полезным инструментом для выявления и выделения антиген-специфичных Т-клетка населения. В последнее время, in vivo биотинилирование белков было разработано для изучения белок-белковых взаимодействий и близость в живых клетках[17][18][19]

Определение степени биотинилирования

Условия реакции для биотинилирования выбираются так, чтобы целевая молекула (например, антитело) была помечена молекулами биотина, достаточными для очистки или обнаружения молекулы, но не настолько, чтобы биотин мешал функции молекулы.

HABA анализ

Анализ HABA (2- (4-гидроксиазобензол) бензойная кислота) можно использовать для определения степени биотинилирования. Краситель HABA связан с авидином или стрептавидином и дает характерное поглощение. Когда вводятся биотинилированные белки или другие молекулы, биотин вытесняет краситель, что приводит к изменению оптической плотности при 500 нм. Это изменение прямо пропорционально уровню биотина в образце. Недостатком анализа HABA является то, что он использует большое количество образца.

Стрептавидин гель-сдвиг

Степень биотинилирования также можно измерить с помощью сдвига геля стрептавидина, поскольку стрептавидин остается связанным с биотином во время электрофорез в агарозном геле или же электрофорез в полиакриламидном геле. Долю биотинилированной мишени можно измерить по изменению интенсивности полосы мишени с избытком стрептавидина или без него, что быстро и количественно можно увидеть для биотинилированных белков с помощью Кумасси бриллиантовый синий окрашивание.[20]

Рекомендации

  1. ^ Лектес, Бенуа; Миготти, Ребекка; Ли, Со Ён; Рамирес, Хуанма; Бераза, Найара; Мэнсфилд, Билл; Сазерленд, Джеймс Д.; Мартинес-Чантар, Мария Л .; Диттмар, Гуннар (06.06.2014). «Профилирование убиквитина в печени с использованием трансгенной мыши с биотинилированным убиквитином». Журнал протеомных исследований. 13 (6): 3016–3026. Дои:10.1021 / pr5001913. ISSN  1535-3893. PMID  24730562.
  2. ^ Барат, Бхасвати; Ву, Анна М. (2007). «Метаболическое биотинилирование рекомбинантного антитела биотинлигазой, удерживаемой в эндоплазматическом ретикулуме». Биомолекулярная инженерия. 24 (3): 283–91. Дои:10.1016 / j.bioeng.2007.02.003. ЧВК  2682619. PMID  17379573.
  3. ^ Samols, D .; Thornton, C.G .; Муртиф, В. Л .; Кумар, Г. К .; Haase, F.C .; Вуд, Х. Г. (1988-05-15). «Эволюционная консервация среди ферментов биотина». Журнал биологической химии. 263 (14): 6461–6464. ISSN  0021-9258. PMID  2896195.
  4. ^ а б Fairhead, M; Ховарт, М (2015). Сайт-специфическое биотинилирование очищенных белков с использованием BirA. Методы молекулярной биологии. 1266. С. 171–84. Дои:10.1007/978-1-4939-2272-7_12. ISBN  978-1-4939-2271-0. ЧВК  4304673. PMID  25560075.
  5. ^ а б Беккет, Дороти; Ковалева, Елена; Шац, Питер Дж. (1999). «Минимальный пептидный субстрат в биотинилировании, катализируемом холофермент-синтетазой». Белковая наука. 8 (4): 921–9. Дои:10.1110 / пс. 8.4.921. ЧВК  2144313. PMID  10211839.
  6. ^ De Boer, E .; Родригес, П.; Bonte, E; Krijgsveld, J; Кацантони, Э; Черт возьми, А; Grosveld, F; Струбулис, Дж (2003). «Эффективное биотинилирование и одностадийная очистка меченых факторов транскрипции в клетках млекопитающих и трансгенных мышей». Труды Национальной академии наук. 100 (13): 7480–5. Bibcode:2003ПНАС..100.7480Д. Дои:10.1073 / pnas.1332608100. ЧВК  164612. PMID  12802011.
  7. ^ Виенс, Антуан; Мехолд, Ундина; Лерманн, Хайке; Харел-Беллан, Анник; Огрызко, Василий (2004). «Использование биотинилирования белков in vivo для иммунопреципитации хроматина». Аналитическая биохимия. 325 (1): 68–76. Дои:10.1016 / j.ab.2003.10.015. PMID  14715286.
  8. ^ Ховарт, Марк; Такао, Кейдзо; Хаяси, Ясунори; Тинг, Алиса Ю. (2005). «Нацеливание квантовых точек на поверхностные белки в живых клетках с помощью биотинлигазы». Труды Национальной академии наук. 102 (21): 7583–8. Bibcode:2005PNAS..102.7583H. Дои:10.1073 / pnas.0503125102. JSTOR  3375578. ЧВК  1129026. PMID  15897449.
  9. ^ Cull, M. G .; Шац, П. Дж. (2000-01-01). Биотинилирование белков in vivo и in vitro с использованием небольших пептидных меток. Методы в энзимологии. 326. С. 430–440. Дои:10.1016 / с0076-6879 (00) 26068-0. ISBN  9780121822279. ISSN  0076-6879. PMID  11036656.
  10. ^ Аргаранья, CE; Кунц, ID; Биркен, S; Аксель, Р; Кантор, CR (1986). «Молекулярное клонирование и нуклеотидная последовательность гена стрептавидина». Нуклеиновые кислоты Res. 14 (4): 1871–82. Дои:10.1093 / nar / 14.4.1871. ЧВК  339579. PMID  3951999.
  11. ^ «Биотинирование белков in vivo».
  12. ^ Пон, Ричард Т. (1991). «Реагент длинноцепочечного биотинфосфорамидита для автоматического синтеза 5'-биотинилированных олигонуклеотидов». Буквы Тетраэдра. 32 (14): 1715–8. Дои:10.1016 / S0040-4039 (00) 74311-5.
  13. ^ Хофманн, Клаус; Вуд, Сара У .; Бринтон, Чарльз С .; Montibeller, Judith A .; Финн, Фрэнсис М. (1980). «Колонки аффинности иминобиотина и их применение для получения стрептавидина». Труды Национальной академии наук. 77 (8): 4666–8. Bibcode:1980PNAS ... 77.4666H. Дои:10.1073 / pnas.77.8.4666. JSTOR  9166. ЧВК  349906. PMID  6933515.
  14. ^ Сугавара, Казухару; Камия, Наото; Хирабаяси, Джордж; Курамиц, Хидеки (2005). «Вольтамперометрический анализ гомогенного связывания биотина без стадии разделения с использованием иминобиотина, меченного электроактивным соединением». Аналитические науки. 21 (8): 897–900. Дои:10.2116 / analsci.21.897. PMID  16122157.
  15. ^ Viens, A .; Харпер, Ф .; Pichard, E .; Comisso, M .; Pierron, G .; Огрызко, В. (2008). «Использование биотинилирования белков in vivo для иммуноэлектронной микроскопической локализации конкретной изоформы белка». Журнал гистохимии и цитохимии. 56 (10): 911–9. Дои:10.1369 / jhc.2008.951624. ЧВК  2544619. PMID  18574249.
  16. ^ Ховарт, Марк; Chinnapen, Daniel J-F; Герроу, Кимберли; Доррестейн, Питер С.; Гранди, Мелани Р.; Kelleher, Neil L; Эль-Хусейни, штат Алабама; Тинг, Алиса Y (2006). «Моновалентный стрептавидин с одним фемтомолярным сайтом связывания биотина». Методы природы. 3 (4): 267–73. Дои:10.1038 / nmeth861. ЧВК  2576293. PMID  16554831.
  17. ^ Фернандес-СуаРес, Марта; Чен, Т. Скотт; Тинг, Алиса Ю. (2008). «Обнаружение белок-белкового взаимодействия in vitro и в клетках с помощью близкого биотинилирования». Журнал Американского химического общества. 130 (29): 9251–3. Дои:10.1021 / ja801445p. ЧВК  2635094. PMID  18582056.
  18. ^ Кулясов, Арман; Шоаиб, Мухаммед; Пичугин Андрей; Каннуш, Патрисия; Раманкулов, Эрлан; Липинский, Марк; Огрызко, Василий (2011). «PUB-MS: основанный на масс-спектрометрии метод мониторинга белок-белковой близости in vivo». Журнал протеомных исследований. 10 (10): 4416–27. arXiv:1108.5657. Дои:10.1021 / pr200189p. PMID  21842862. S2CID  16887424.
  19. ^ Shoaib, M .; Кулясов, А .; Робин, С .; Winczura, K .; Тарлыков, П .; Despas, E .; Kannouche, P .; Раманкулов, Э .; Липинский, М .; Огрызко, В. (2012). «ПУБ-НЧИП - метод« биотинилирования in vivo »для изучения хроматина в непосредственной близости от интересующего белка». Геномные исследования. 23 (2): 331–40. Дои:10.1101 / гр.134874.111. ЧВК  3561874. PMID  23038767.
  20. ^ Jain, J .; Veggiani, G .; Ховарт, М. (2013). «Нагрузка холестерина и сверхстабильные белковые взаимодействия определяют уровень опухолевого маркера, необходимый для оптимального выделения раковых клеток». Исследования рака. 73 (7): 2310–21. Дои:10.1158 / 0008-5472.CAN-12-2956. ЧВК  3618857. PMID  23378340.

дальнейшее чтение